200939. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS technikával előállított hTNF stabilizálására
HU 200939 B aktivitásra értékeljük. Azokban a sávokban, amelyek az endotoxint tartalmazó sejttenyészet felülúszóján fejlődnek ki, L sejtek elleni citotoxicitást figyelünk meg annál a helynél, amely a 17 500 molekulasúlynak felel meg. Más helyzeteknél citoto»citás nem figyelhető meg. 6. lépés Az mRNS extrakciója A 4. lépésben készített sejttenyészetet két órán át inkubáljuk az endotoxin beadása után, ezt követi a centrifugálás a ejtek összegyűjtése érdekében. A citoplazmás RNS kivonását az összegyűjtött sejtekből és az mRNS kivonását a citoplazmás RNS-ből Chirgwin és munkatársainak módszerével [lásd: Chrigwin, J. M. és munkatársai: Biochemistry, 18. kötet, 5294. oldal (1979)] összhangban hajtjuk végre. 4 ml 4 mól/literes guanidin tiocianát oldatot adunk 3.108 sejthez, és a keveréket porítjuk homogenizáló berendezésben (AM-7 modell, gyártja és forgalmazza: Nikon Seiki Seisakusho, Japán). A maradékot centrifugálással eltávolítjuk és 2,4 g cézium-kloridot oldunk benne. A keveréket óvatosan poliallomer csőbe öntjük, amelybe előzőleg 2,5 ml, 5,7 mól/liter cézium-kloridot és 0,1 ml/liter EDTA- t (pH 7,5) tartalmazó oldatot helyeztünk, majd ultracentrifugálásnak vetjük alá 30 000 fordulat/percnél 12 órán át 20 °C hőmérsékleten, Beckman Instrument, USA). A felülúszó eltávolítása után a szemcséket 1 ml 10 mmól/literes Trisz-HCl pufferben (amely 5 mmól/liter EDTA-t és 1% (súly/térf) SDS-t tartalmaz) feloldjuk. Az így létrejött oldatot kloroform-1-butanol 4:1 térfogat arányú keverékével extraháljuk. A vizes fázishoz 0,05 térfogat 2 mól 4:1 térfogat arányú keverékével extraháljuk. A vizes fázishoz 0,05 térfogat 2 mól/literes nátrium-acelátot és 2,5 térfogat etanolt adunk, és -20 °C hőmérsékleten állni hagyjuk 2 órán át vagy tovább, ezáltal kicsapjuk az RNS-t. A csapadékot centrifugálással összegyűjtjük, szárítjuk, majd 500 pl steril vízben feloldjuk. A művelet eredményeképpen citoplazmás RNS oldatát nyerjük. A fentebb említett RNS oldatot 68 °C hőmérsékleten melegítjük 2 percen át, majd gyorsan lehűtjük. 500 pl kétszeres koncentrációjú 10 mmól/literes Trisz-EDTA puffert (pH 7,4) (amely 1 mmól/liter EDTA-t, 0,1% (súly/térfogat) SDS-t és 0,5 mmól/liter lítium-kloridot tartalmaz) adunk az oldathoz, és a keveréket 200 mg-os oligo dT-cellulóz oszlopra (gyártja és forgalmazza: Bethesda Research Laboratories, Inc., USA) visszük, mint amelyet fentebb leírtunk. Az oszlop által visszatartott anyagot 2 ml eluáló pufferral eluáljuk, amely 10 mmól) liter Trisz-HCl-puffert (pH 7,4), 1 mmól/liter EDtA-t és 0,1% (súly/térf.) SDS-t tartalmaz. Az eluátumhoz 0,05 térfogat nátrium-acetátot és 2,5 térfogat etanolt adunk, és a keveréket -20 °C hőmérsékletre hűtjük, hogy kicsapódás következzék be. A csapadékot centrifugálással összegyűjtjük, és oligo dT- cellulóz oszlopra visszük, és az oligo dT-cellulózra adszorbeált frakciókat összegyűjtjük. 85 pgmRNS- t kapunk, amint ezt az ultraibolya spektrum elemzéssel meghatároztuk. 7 7. lépés 15 Az mRNS méret szerinti frakcionálása 880 pg mRNS-t, amelyet a 6. lépésben leírtakkal azonos módon készítünk, feloldunk 250 pl vízben, és az így létrejött oldatot 10 ml 5-25%-os lineáris szacharóz sűrűség gráfiensre rétegezzük. A szacharóz sűrűség-grádienst ISCO 570 grádienskészítővel (grafienter, gyártja és forgalmazza: ISCO Inc., USA) készítjük, Trisz puffer oldatot [amely 25 mmól/liter Trisz-HCl-t (pH 7,2), 2 mmól/liter EDTA-t és 1% (súly/térf.) SDS-t tartalmaz], illetve 5%-os szacharózt és 25%-os szacharózt alkalmazva. Beckman SW41 rotort alkalmazva ultracenlrifugálást hajtunk végre 40 000 rpm-nél 12 órán át 4 °C hőmérsékleten, és 400-400 pl-es frakciókat nyerünk frakciószedő berendezés segítségével (gyártja és forgalmazza: Beckman Instrument, USA), majd etanollal kicsapjuk. A kicsapott frakciókat centrifugáljuk, és steril vízben feloldjuk. 8. lépés Kísérletek az mRNS transzlációjára A Xenopus laevis (Hamamatsu biológiai oktatóanyaga) oocitáit alkalmazó mRNS transzlációt kísérleti beszámolókban leírt eljárás szerint hajtjuk végre (ilyen pl: Hiroshi Teraoka, Mikio Itsuki és Kentaro Tanaka: „Protein, Nucleic Acid, Enzyme, Genetic Engineering, 1981. évi különkiadás, 602. oldal). A Xenopus leavis beszerezhető a Hamamatsu biológiai oktatóanyagokból. A 7. lépésben nyert frakciónált mRNS-t steril vízben feloldjuk, hogy koncentrációja 1 pg) 1 legyen, és az oldatot az oocitákba injektáljuk igen csekély, 5 nl/sejt menynyiségben. A sejteket ezután 24 órán át Barth-féle oldatban tenyésztjük [az oldat 7,5 mmól/liter Trisz- HCl-t (pH 7,6), 88 mmól/liter NaCl-t, 1 mmól/liter kálium-kloridot, 0,33 mmól/liter kaldumnitrátot, 0,41 mmól/liter kalcium-kloridot, 0,82 mmól/liter magnézium-szulfátot, 2,4 mmól/liter nátrium-bikarbonátot, 18 egység/ml G penicillint és 18 pg/ml streptomicint tartalmaz], amely még 1 mg/ml bovin szérum albumint is tartalmaz. Az oodtákat a tenyészfolyadékban összezúzzuk üvegbot segítségével. A tenyészfolyadékot ezután centrifugáljuk, és a felülúszót L sejtek elleni citotoxikus aktivitásra értékeljük. Az mRNS, amely majd transzlálódik, hogy egy polipeptidet adjon, a maximális aktivitású üledéket 16S méretnél adja. Ezt az aktivitást az anti- TNF-antitest, amelyet a 3. lépésben nyerünk, eltünteti, de a normál egér szérum nem tünteti el. 9. lépés A transzformánsok készítése 5 pg, a 7. lépésben nyert frakdonált mRNS-t alkalmazva kettős szálú DNS-t készítünk az (1) irodalmi helyen (96. oldal) leírt eljárással összhangban. Reverz transzkriptázként a Life Sdence Inc., USA termékét használjuk. A kettős szálú DNS- eket méret szerint frakcionáljuk 3,5%-os poliakrilamid DNS-eket méret szerint frakcionáljuk 3,5%os poliakril-amid gélen, és 330 ng 1000 és 2000 bp közti frakciót nyerünk. Az (1) irodalmi helyen leírt eljárással összhangban 7 ng ilyen frakciót kiegészítünk dezoxi C gyökkel, terminális dezoxonukleotid transzferázt (gyártja és forgalmazza: Bethesda Re-16 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
