200939. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS technikával előállított hTNF stabilizálására
HU 200939 B a következő módon hajtjuk végre. Tenyésztő edényként 96 üreges mikrotitráló lemezt [amelyet a Flow Laboratories, Inc. (USA) gyárt] alkalmazunk, és az L-M sejteket Eagle-féle minimális esszenciális tápközegben [lásd: Science, 130,432-437 (1959)] tenyésztjük, amely 10% (térf./térf) borjú-embriószérumot is tartalmaz. 0,1 ml-es mintából sorozathígítást készítünk a tápközeggel és az L-M sejtek szuszpenzióját (0,1 ml, 1.104sejt) összekeverjük a lemez mindegyik üregében, majd a lemezeket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 48 órán át olyan levegőben, amely 5% széndioxidot tartalmaz. A tényésztési időszak végén 20%-os vizes glutáraldehid-oldatot (20 (xl) adunk hozzá, hogy a sejteket rögzítsük. A rögzítés után a lemezeket desztillált vízzel mossuk és hagyjuk megszáradni, és 0,05%-os metilénkék oldatot adunk hozzá (0,1 ml), hogy megfessük az élő sejteket. A lemezeket alaposan lemossuk desztillált vízzel, hogy eltávolítsuk a festék fölöslegét, majd hagyjuk megszáradni. 3%-os sósavoldatot (0,2 ml) adunk minden egyes üreghez, hogy extraháljuk a festéket a megfestett sejtekből. Mindegyik üreg abszorbanciáját mérjük 665 nm-nél Titertek Multiskan műszerrel, amely a Flow Laboratories, Inc., USA gyártmánya. Az abszorbancia arányos az élő sejtek számával. Az aktivitást, egység (U)/ml-t úgy definiáljuk, mint annak a TNF oldatnak a reciprok hígítását, amely 50% citotoxicitást idéz elő, és ezt úgy nyerhetjük, hogy egy ábrában a hígítást az abszorbancia függvényében ábrázoljuk. Az összes aktivitást, amelyet e szerint az in vitro módszer szerint mérünk, és ezután alkalmazunk, a fentebb definiált egységben fejezzük ki, kivéve az 1. és 2. referencia-példákban. Az 1. és 2. referenciapéldában az aktivitást lényegében ugyanezzel a módszerrel mérjük a következő különbségekkel: L924 sejteket (American Type Culture Collection, CCL1) alkalmazunk az L-M sejtek helyett; olyan Ealge-féle minimális esszenciális tápközeget alkalmazunk, amely 1% (térf./térf.) borjú-embrió szérumot és 5 |xg/ml aktinomicin D-t tartalmaz a 10% (térf./térf.) borjú-embrió szérumot tartalmazó Eagle-féle minimális esszenciális tápközeg helyett, és az inkubálást 21 óra alatt hajtjuk végre 48 óra helyett. A jelen találmány módszere szerint a nagy mértékben tisztított fiziológiailag aktív vegyület, amelyről úgy vélik, hogy klinikailag alkalmazható, hatásos tumorellenes gyógyszer lesz, ipari léptékű, hatásos és állandó szolgáltatását biztosíthatjuk, mivel a jelen találmány szerinti módszerben az aktív vegyület aktivitását fenn lehet tartani a tárolás során, az aktív vegyület akár oldat, akár fagyasztott massza, akár liofilezett készítmény formájában van, valamint a tisztítás és gyógyászati készítmény előállítás lépései során. Úgy találtuk, hogy az oldatot vagy port, amelybe humán albumin van beépítve, biztonságosan be lehet vezetni az emberi testbe, minélfogva a jelen találmány szerinti új kompozíció különösen hatásos akkor, amikor a fiziológiailag aktív vegyületet tumorellenes gyógyszerként klinikailag alkalmazzuk. A jelen találmányt ezután részletesebben leírjuk a következő referencia-példákban, műveleti példákban és összehasonlító példákban, ezek azonban 11 semmiképpen sem szándékoznak a találmány oltalmi körét korlátozni. A jelen találmány gyakorlati kivitelezésében a rekombináns DNS megalkotását és egy rekombináns DNS beiktatását egy mikroorganizmusba a következő kísérleti beszámolókban leírt eljárásokkal összhangban végezzük, hacsak másképpen nem jelezzük. A kísérleti beszámolók a következő irodalmi helyeken találhatók (1) Yasutaka Takagai: Manual For Genetic Engineering, Kodan-Sha, Tokyo, (2) Yasutaka Takagai: Experimental Method in Genetic Engineering, Kodan-Sha, Tokyo, (3) T. Maniatis, E. F. Fritsch, J. Sambrook: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (4) Ray Wu és munkatársai: Methods in Enzymology, 101. Kötet, Academic Press, New York. A referencia-példákban és példákban alkalmazott rövidítések MOPS: morfolino-propánszulfonsav LB tápközeg: Luria-Bertani tápközeg DMSO: dimetil-szulfoxid PFU: tarfolt (plakk) képző egység EDTA: etilén-diamin-tetraecetsav SDS: nátrium-dodecil-szulfát BRL: Bethesda Research Laboratories Inc. DMT: dimetoxi-tritil lac: laktóz Trisz: trisz(hidroxi-metil)-amino-metán XAR-5: az Eastman Kodak Company, USA által gyártott és forgalmazott röntgenfilm lxSSC: 0,15 mól/liter NaCl + 0,015 mól/liter nátrium-citrát, pH 7 2xSCC: 0,30 mól/liter NaCl + 0,030 mól/liter nátrium-citrát, pH 7 3xSCC: 0,45 mól/liter NaCl + 0,045 mól/liter nátrium-citrát, pH 7 5xSCC: 0,75 mól/liter NaCl + 0,075 mól/liter nátrium-citrát, pH 7 6xSSC: 0,90 mól/liter NaCl + 0,090 mól/liter nátrium-citát, pH 7 FDSS: 50% ionmentesített formamid + 5xDenhardt-féle oldat + 5xSSPE + 0,1% SDS + 100 ixg/ml denaturált borjú timusz DNS (SSPE: 0,18 mól/liter NaCl + 10 mmól/liter NaH2P04 + 1 mmól/liter EDTA, pH 7,4) SM: fág tároló tápközeg, amely 5,89 NaCl-t, 2 g MgS04.7H20-t, 50 ml 1 mól/literes Trisz.HCl-t (pH 7,5) és 5 ml 2%-os zselatint tartalmaz literenként. NZ-tápleves: olyan tápközeg, amely 10 g NZ amint, 5 g NaCl-t és 2 g MgSC>4.7H20-t tartalmaz (az NZ amin A-típusú kazein-hidrolizátum, amelyet a Humko Sheffield Chemical Division of Kraft, In., USA, gyárt és forgalmaz) IPTG: izopropil-tiogalaktozid x-gal: 5-dibróm-4-klór-3-indolil-galaktozid TAE: 0,04 mól/liter Trisz-acetát (pH 8,0)-0,002 mól/liter EDTA 5xDenhardt-féle oldat: vizes oldat, amely 1000 mg Ficoll-t, 1000 mg polivinil-pirrolidont és 1000 mg BSA-t (bovin szérum albumin) tartalmaz literenként bp: bázispár 12 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
