200939. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS technikával előállított hTNF stabilizálására
HU 200939 B «okát YT lemezekre szúrjuk át. A kiónokat hagyjuk Mbridizálódni, 55 °C hőmérsékleten 2 órán át rvel jelzett E3-4-el. Pozitív kiónokat nyerünk és a fág DNS-t szekvencia analízisnek vetjük alá, hogy kiválasszuk azokat a fágokat, amelyekben a 3. intron teljesen ki van iktatva. Egy ilyen fágot mp 3-HGE A 3-1-nek jelölünk. 17. lépés A pHTNF-lac UV 5-2 megalkotása Az mp 9-HGE A 3-1 replikálódó formáját emésztjük Eco RI-vel. Az Eco Rí fragmenst izoláljuk és klónozzuk Eco RI-vel hasított pBR 327-hez, hogy a pHGE A 3-1 plazmidot termeljük ki. Egy további plazmid megalkotását is véghezvisszük a pHGE A 3-1 plazmidot használva, hogy olyan A 3-1 plazmidot nyerjünk, amely közvetlenül kifejezi a TNF-et E. coli-ban, /acUV5-öt használva promotorként. Az eljárást a 7. ábra mutatja be. Először 10 jxg pHGE A 3-1-et emésztünk 10 egység Ava I-vel és Eco RI-vel (gyártja és forgalmazza: Bethesda Research Laboratories, Inc., USA) 37 °C hőmérsékleten 2 órán át, és elektroforézisnek vetjük alá 4 súly%-os poliakrilamid-gélen, hogy fragmenseket izoláljunk. Mintegy 1 |xg fragmenst izolálunk a gélről elektroelucióvaí. Azonos módon, mint a 14. lépésben, két oligodezoxinukleotidot, amint ezt a 7. ábrában bemutatjuk, nevezetesen az 5’AATTCATGTCATCTTCTCGAACC-3’-t és az 5’TCGGGGTTCGAGAAGATGACATG-3’-t, szintetizálunk. Azután a két oligodezoxinukleotid (kb. 100 pmól) 5’-végét foszforilezzük T4 polinukleotid-kinázt alkalmazva a (3) irodalmi hely 122. oldalán leírt módszerrel összhangban. A reakció teljessé válása után a reakciókeveréket extraháljuk fenollal, majd kloroformmal. Ezután az így nyert szintetikus oligomereket összekeverjük 0,5 jjLg, a pHGE A 3-1 plazmidból korábban nyert A va I-Eco Rí fragmenssel, és etanollal kicsapjuk. Ezeket a fragmenseket ligáljuk 4 °C hőmérsékleten, 10 egység T4 ligázt alkalmazva az (1) irodalmi helyen, a 37. oldalon leírt módszerrel összhangban. A reakció teljessé válása után a keveréket etanollal kicsapjuk, ezt követi azelektroforézis, amelyet 4 súly%-os poliakrilamid gélen hajtunk végre, hogy a fragmenst elektroelucióvaí kinyerjük. Az F. Fuller által leírt módszerrel [Gene, 19, 42-54 oldal, (1982)] összhangban állítjuk elő a pOP95-15 plazidot. 1 |xg pOP95-15-öt emésztünk Eco RI-vel és fenollal, majd kloroformmal extraháljuk, majd etanollal kicsapjuk, így egy vektort nyerünk. T4 DNS ligázt alkalmazva 0,5 |xg-ot a nyert vektorból Egálunk a fentebb említett fragmenssel. A (4) irodalmi hely 20. oldalán leírt módszerrel összhangban E. coli JM101-et (ATCC 33876) transzformálunk, a fentebb nyert vektort alkalmazva, és agar-tápközegen tenyésztjük, amely 1 mmól/liter IPTG-t és 0,004% (súly/térf.) X-gal-t tartalmaz, így kb. 100 fehér telepet nyerünk. Ezekből a transzformánsokból plazmid DNS-t állítunk elő, és emésztjük Eco RI-vel, hogy azonosítsuk azokat a plazmidokat, amelyek tartalmazzák a szóban forgó Eco Rí fragmenst. Abból a célból, hogy megvizsgáljuk a beiktatás irányát, ezeket a 37 plazmidokat Pvu II-vel és Pst I-el emésztjük és elektroforézisnek vetjük alá 1,5 súly%-os agarózgélen, hogy kiválasszuk a kb. 1280 bázis-páros és 2600 bázis-páros fragmenseket előállító plazmidokat, így jelezve, hogy a lac UC 5 promotor átírásának iránya egyezésben van a TNF-et kódoló oligodezoxinukleotidok irányával. A bázis-szekvencia analízis azt mutatja, hogy ennek a két plazmidnak a szekvenciája azonos és hogy a lac U V 5 promotor, a szintetizált oligodezoxinukleotid és a DNS megfelelően kombinálódik egymással. A nyert plazmidot pHTNF-lac UV 5-2- vel jelöljük. A pHTNF-lacUV5-2-t tartalmazó E. coli-t hagyományos tápközegben tenyésztjük. A termék biológiai vizsgálata TNF aktivitásra csaknem azonos aktivitást jelez, mint amelyet a nyúl TNF gént tartalmazó pTNF-lacUV5-l plazmiddal nyerünk a lac promotor szabályozása alatt. 3. referencia-példa A 2. referentcaial-példa 1-14 lépéseiben leirt eljárássalá nyert 1-4 oligonukleotidokat és a pHGE plazmidot alkalmazva, pHTNF-lac UV5-l-et állítunk elő a 6. ábrában bemutatott folyamattal összhangban. 1. példa A 3. referencia-példa szerint előállított pHTNF- lacUV5-2-t tartalmazó E. coli-t tenyésztünk valamely hagyományos tápközegben és indukciót végzünk a szokásos módszer szerint. Az E. colit tovább tenyésztjük, hogy a jelen találmányban alkalmazandó fiziológiailag aktív anyagot tartalmazó E. coli sejtjeit nyerjük. A sejteket centrifugálással összegyűjtjük és a sejteket lizisnek vetjük alá ultrahangos kezeléssel 1 liter 0,04 mól/literes Trisz-HCl pufferban (pH 7,8), így fiziológiailag aktív vegyületet tartalmazó sej-extraktumot nyerünk. A sejt-extraktum 4,5.10s egység/ml citotoxikus aktivitást mutat. Az aktív vegyület fajlagos aktivitása az extraktumban 3,0.104 egység/mg fehérje. Ezután az extraktumot DEAE-Sepharose CL- 6B (gyártja a Pharmacia Fine Chemicals AB, Svédország) oszlopra visszük, amely megfelelően ki van egyensúlyozva 0,04 mól/literes Trisz-HCl pufferral (pH 8,0) és ezután az eluálást 0,1 mól/liter NaCl-t tartalmazó 0,04 mól/literes Trisz-HCl puffert alkalmazva hajtjuk végre. Az aktív frakciókat összegyűjtjük és ultraszűréssel koncentráljuk, ezáltal nyers oldatot kapunk, amely aktív vegyületet tartalmaz, amely 4,0.10s egység/mg fehérje fajlagos aktivitással rendelkezik. Az így nyert nyers oldatot Sephacryl S-200 (gyártja: Pharmacia Fine Chemicals AB, Svédország) oszlopra visszük, amelyet 0,15 mól/liter NaClt tartalmazó 5 mmól/literes foszfát-puferral (pH 7,4) egyensúlyoztunk ki, ezt követi a gélszűrés ugyanezzel a púderral. Az aktív frakciókat összegyűjtjük és ultraszűréssel koncentráljuk, ezáltal a fiziológiailag aktív vegyületet tartalmazó oldatot nyerjük, amelynek fajlagos aktivitása 7,0.10s egység/mg fehérje. A nyert oldat egy alikvotját 0,5 mól/liter NaCl-t tartalmazó 5 mmól/litereres foszfát pufferral (pH 7,4) hígítjuk, így a fiziológiailag 38 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 20
