200939. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS technikával előállított hTNF stabilizálására

HU 200939 B

kicsapás etanollal a vektor kinyerésére, T4 DNS ligázt alkalmazva 0,5 így nyert vektort ligálunk a szintetikus oligonukleotid TNF-et kódoló oligonukleotiddal történd ligálásával nyert fragmenssel (kb. 670 bp). A (4) irodalmi helyen, a 20. oldalon 5 leírt eljárással összhangban E. coli JM101-et (ATCC 33876) transzformálunk a fent említett vektort alkalmazva, és tenyésztjük olyan tápközegen, amely 1 mmól/liter IPTG-t és 0,004% (súly/térf.)

X-gal-t tartalmaz, így kb. 150 fehér telepet nyerünk. 10

Plazmid DNS-t preparálunk ki ezek közül a telepek közül 100-ból, és emésztjük EcoRI-vel. Végeredményben azt találjuk, hogy 12 plazmid tartalmazza a szóban forgó EcoRI fragmenst (kb. 670 bp). Abból a célból, hogy megvizsgáljuk a beiktatott rész 15 irányát, a fenti 12 plazmidot Pvu II-vel és Pst I-el emésztjük és elektroforézisnek vetjük alá, 1,5 súly%-os agaróz gélen. Ennek eredményeként azt állapítjuk meg, hogy 4 plazmid rendelkezik a kívánt fragmensekkel (kb. 128 bp és kb. 2600 bp), és hogy 20 a lacUVs promotor átírásának iránya egyezésben van a TNF-et kódoló oligodezoxinukleotidok irányával.

A bázis-szekvencia elemzés azt mutatja, hogy ennek a négy plazmidnak a bázis-szekvenciája azo- 25

nos, és hogy a lac UV5 promotor, a szintetikus oligodezoxinukleotid és a cDNS megfelelően kombinálódnak egymással. Az így nyert plazmidot pTNF-lacUV5-1-nek jelöljük.

30

17. lépés

Az E. coli által termelt TNF tisztítása

A 16. lépésben nyert plazmidot tartalmazó E. coli törzset 50 ml LB tápközegben, amely még 100 |ig/ml amplicillint is tartalmaz, tenyésztjük 37 °C

23

hőmérsékleten egy éjszakán át. Ezután a törzs tenyészetét átvisszük 5 liter LB tápközegbe, amely még 100 p/y/pX ap.'iux'-kXivr TapraXp.a£, 'or to— •nrXßß tsviJ»'o{t9 k 37 (X t] 2s p/pa'tcXeTev TjXpop. pXv Xt. Iío-irpoiuX- ßD-tiogalaktopiranozidot (gyártja és forgalmazza: Sigma Chemical Company, Inc., USA) adunk hozzá, hgoy végső koncentrációja 1 mmól/liter legyen. További tenyésztést hajtunk végre 6 órán át, ezt követi a hűtés. A törzsek sejtjeit centrifugálással gyűjtjük össze. Azonos módon, ahogyan a 13. példában leírtuk, a törzsek sejtjeit 5 liter 0,04 mól/literes T risz-HCl puffer-oldatba adjuk (pH 7,8) és ultrahangos kezeléssel elroncsoljuk, hogy a törzs fehérjének oldatát nyerjük. A nyert oldatnak 5.102 * * * * 7 egység) liter aktivitása van L-sejtek ellen.

A nyert oldatot ugyanolyan módon tisztítjuk, mint a 2. lépésben, így nyerünk 1,2.106 egység TNF- et. A TNF fajlagos aktivitása 6,8.107 egység/mg.

18. lépés

Értékelés egerekbe transzplantált Meth A szarkómát alkalmazva

0,20 ml, a 17. lépésben nyert, TNF mintát vetünk alá értékelésnek a korábban leírt in vivo mérési módszer szerint.

Ezen túl 20 nappal a minta injektálása után megfigyeléseket teszünk a tumorok elsatnyulását illetően, és meghatározzuk a gyógyulási hányadot a következő egyenlet szerint:

egerek száma, amelyek teljesen felgyógyul- Gyógyulás hányad = tak a tumorból a vizsgákhoz használt egerek száma Az eredményeket a 3. Táblázat mutatja be.

24

3. Táblázat

E. coli által termelt nyúl TNF injektált mennyisége egység/egér

A vizsgálathoz használt egerek száma

Értékelés a minták aktivitására 1 nap múlva + + ++ + +

Gyógyulási hányad 20 nap után

2.105

5

0 0 14

5/5

Referencia-anyag

5

5 0 0 0

0/5

(fiziológiás sóoldat)

2. referencia-példa

1. lépés

E. coli K12 MC1061 törzs transzformálása pR

18, pB 2-7 és pB 2-2 plazmidokkal

E. coli K12 MC1061 törzs telepeit transzformáljuk egyenként az 1. referencia-példa 13. lépése szerint nyert pR 18, pB 2-7 és pB 2-2 plazmidokkal a szokásos eljárások szerint. Részletesebben, az E. coli K12 MC1061 törzset LB tápközegben tenyésztjük, amíg a tenyésztő tápleves optikai sűrűsége nem éri el a 0,3 értéket 550 nm-nél. A kinövesztett E. coli tenyészet 50 ml-éből a sejteket kinyerjük, 25 ml, 10 mmól/liter MOPS-t (pH 7,0) és 10 mmól/liter RbCl-t tartalmazó keverékkel mossuk, és újra szuszpendáljuk 25 ml 0,1 mól/liter MOPS-t (pH

50 6,5), 50 mmól/liter CaCb-t és 10 mmól/liter RbCl-t

tartalmazó oldatban. Az így létrejött szuszpenziót jégben hűtjük 30 percen át, centrifugáljuk és szuszpendáljuk 2 ml fentiekben említett keverékben, amely 0,1 mól/liter MOPS-t (pH 6,5), 50 mmól/liter 55 CaCh- és 10 mmól/liter RbCl-t tartalmaz, valamint 30 |j.l DMSO-ban. Az így létrejött szuszpenzió egyegy 200 ml-es alikvótját külön-külön hozzáadjuk a plazmid DNS oldatok mindegyikének 10 pl-éhez. Az összes így létrejött keveréket jégben hűtjük 30 60 percen át, majd hővel sokkoljuk 44 °C hőmérsékleten 60 másodpercen át. Azonnal ezután 5 ml, 37 °C hőmérsékleten előmelegített LB tápközeget adunk a melegített keverékek mindegyikéhez, majd inkubáljuk ezeket 37 °C hőmérsékleten egy órán át. Az 65 így nyert tenyészlevek mindegyikét centrifugálás-