200939. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS technikával előállított hTNF stabilizálására
HU 200939 B A találmány tárgya eljárás rekombináns DNS technikával előállított hTNF stabilizálására, mely szerint a rekombináns DNS technikával készült, fiziológiailag aktív, tumorellenes hatású vegyületet tartalmazó vizes odlathoz vagy porhoz albumint adnak Ismeretes, hogy van olyan fiziológiailag aktív anyag, amely emberből származik, és amelynek citotoxikus aktivitása van L-M sejtek ellen, és amely képes indukálni egy átültetett tumor, a Mth A szarkóma vérzéses elhalását (hemorrhagiás nekrózis) BALB/c egerekben. Az ilyen fiziológiailag aktív vegyületeknek tumorellenes aktivitása van és ezt humán tumor elhalási faktornak (Tumor Necrosis Factor) nevezik, ezt a továbbiakban gyakran idézzük és „humán TNF-nek jelöljük. Az is ismeretes, hogy egy ilyen fiziológiailag aktív vegyületnek nincs toxikus hatása a normális sejtekre in vitro. Sőt, mivel a fiziológiailag aktív vegyület emberből származik, nincs az a veszély, hogy anafilaxiás sokk lép fel, amelyet egy olyan anyag beadása okozhatnak, amely nem ember-eredetű. Ennél fogva az elvárás a fentebb említett fiziológiailag aktív anyag, mint tumorellenes gyógyszer klinikai alkalmazására igen nagy a szakterületen. Annak érdekében, hogy biztosítsuk a humán TNF, mint tumorellenes gyógyszer széles körű és biztonságos klinikai alkalmazását, szükséges a humán TNF-et nagyon tisztított formában nyerni. Már korábban javasoltak egy módszert humán TNF nyerésére rekombináns DNS technikával. A 158 286 közzétételi számú európai szabadalmi leírásban javasolt módszer szerint a kívánt humán TNF- et lényegében tiszta formában elő lehet állítani nagy léptékben. A javasolt módszer a következőkből áll:- humán TNF-et kódoló dezoxiribonukleinsav ligálása replikálódásra képes kifejeződd (expressziós) hordozóhoz, hogy olyan replikálódni képes rekombinán&DNS-t nyerjünk, amely tartalmazza az említett dezoxiribonukleinsavat és az említett, replikálódni képes kifejeződő hordozót;- egy mikroorganizmus vagy sejttenyészet sejtjeinek transzformálása az említett replikálódni képes rekombináns DMS-sel transzformánsok képzésére;- az említett transzformánsok elkülönítése a mikroorganizmus vagy sejttenyészet szülőtörzseitől;- az említett tranfzrománsok inkubálása, amely az említett transzformánsokban az említett dezoxiribonukleinsavak kifejeződését és humán TNF termelését idézi elő; és- az említett humán TNF elkülönítése az inkubált transzformánsoktól, amelyet tisztítás követ. Amint fentebb említettük, a javasolt, rekombináns DNS technikát alkalmazó módszer szerint előnyösen lehet nyerni a kívánt humán TNF-et lényegileg tiszta formában nagy léptékben. Amikor azonban a tumorellenes gyógyszerként használandó humán NTF nagyléptékű előállítását hajtják végre, általában szükséges tárolni a lényegében tiszta humán TNF-et oldat vagy fagyasztott massza formájában hosszú időtartamon át, és liofilezni az aktív anyag oldatát. A jelen találmány feltalálói azonban arra jöttek rá, hogy a lényegében tiszta 1 humán TNF aktivitása jelentősen csökken a tárolás, fagyasztás, felengedtetés és liofilezés során. Megjegyezzük továbbá, hogy a rekombináns DNS technikával előállított lényegében tiszta TNF tárolása során, amíg a TNF-et ténylegesen beadják a rákban szenvedő betegnek, a TNF aktivitása szintén jelentősen csökken. A tumorellenes aktivitással bíró fehérjék stabilizálásáról már jelentek meg közlemények. így például: A 4 447 355 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás TND előállítására alkalmas eljárást ismertet, amely a szerzők szerint alkalmas humán TNF előállítására is. Azonban csak nyúl plazmából nyert TNF-ből kiinduló eljárást írnak le példa szinten, és csak nyúl plazmából származó TNF-nek albuminnal történő stabilizálását ismertetik a leírásban. Az 59 59625 közzétételi számú japán szabadalmi leírás szerint cukrokkal, például d-glükózzal stabilizáljuk a nyúl TNF-t. Az 59 59625 közzétételi számú japán szabadalmi leírás szerint nemionos felületaktív anyagokkal, például polioxietilén-lauráttal stabilizálják a nyúl TNF-t. Amennyire a jelen találmány feltalálói tudatában vannak, nincsen viszont olyan közlemény, tiszta humán TNF hatékony és állandó szolgáltatását, különösen ipari léptékben, nem lehet biztosítani, még annak tudatában sem, hogy a humán TNF hatásos tumorellenes gyógyszer. Hogy túllépjék a fentebb megvilágított nehézséget a fiziológiailag aktív anyag stabilitása tekintetében, a jelen találmány feltalálói kiterjedt és intenzív tanulmányokat végeznek. Ennek eredményeként úgy találtuk egészen meglepő módon, hogy hatásos mennyiségű albumin, mint stabilizálószer hozzáadása a fiziológiailag aktív anyagot tartalmzó vizes oldathoz vagy porhoz, lehetővé teszi, hogy a tárolandó anyag meghosszabodott időtartamon át létezzen aktivitásveszteség nélkül, és stabillá teszi az anyagot az elkülönítés, és tisztítás eljárásai során, valamint a fagyasztás, felengedtetés, liofilezés és hasonló műveletek folyamán. A jelen találmányt erre az új felismerésre alapoztuk. Ennél fogva a jelen találmány tárgya eljárás rekombináns DNS technikával előállított, fiziológiailag aktív anyag különösen hTNF stabilizálására. A jelen találmány tárgya és előnyei nyilvánvalóak lesznek azok számára, akik a szakterületen jártasak, a következő részletes leírásból, igénypontokból, valamint az ezekkel kapcsolatos mellékelt ábrákból. Az ábrák a következőket mutatják be. Az 1. ábra plazmidok beiktatásait mutatja be, minden beiktatás (inzert) egy hagyományos fiziológiailag aktív nyúl polipeptidet kódoló DNS-t tartalmaz. A 2. ábra a hagyományos fiziológiailag aktív nyúl polipeptidet kódoló rekombináns DNS (pTNF- lac-1) előállítására szolgáló módszer folyamatábráját mutatja be. A 3. ábra a hagyományos fiziológiailag aktív nyúl polipeptidet kódoló másik rekombináns DNS (pTNF-lacUV5-l) előállítására szolgáló módszer folyamatábráját mutatja be. A 44. ábra a jelen találmányban alkalmazandó 2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
