200797. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-lizin előállítására
3 HU 200797 B 4 A mikroorganizmusokra, amelyeket szülő törzsként alkalmazhatunk a jelen találmány szerinti mutáns törzsek kialakításához, előnyös példák lehetnek a Corynebacterlum glutamicum ATCC 13032, Corynebacterlum glutamicum H-3149 (FERM BP-158), Corynebacterlum acetoacldophilum ATCC 13870, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869,és Brevibacterium flavum ATCC 14067; mindezek a törzsek fermentációval L-lizin termelésére képesek. Azokat a mutáns törzseket, amelyeket a jelen találmány céljaira fel lehet használni, olyan hagyományos módokon lehet kialakítani, amelyeket mutáns törzsek kialakítására általában alkalmazni szoktak, ilyenek pl. besugárzás ultraibolya sugarakkal, kémiai kezelés pl. N-metil-N’-nltro-N-nitrozo-guanldint alkalmazya, stb. A kívánt mutáns törzseket a mutációnak kitett mikroorganizmusoktól olyan módon lehet elkülöníteni, hogy megfelelő tápközegben, pl. bóta-naftoklnolint tartalmazó minimál tápközegen agar lemezen növekvő mutáns törzseket gyűjtünk, ahol a béta-naftokinolin olyan koncentrációban van Jelen, amely a szülőtörzs növekedésének gátlásához elegendő (pl. több, mint 40 i^g/ml), és ezeket átvizsgáljuk béta-naftokinolin-rezisztenciára és L-lizin termelésre. A Corynebacterlum glutamicum H-4412 mikrobiális mutáns törzset, amely béta-naftokinollnra rezisztens, és amelyet a természetben előforduló H-3149 szülőtörzs mutálásával alakítottunk ki, letétbe helyeztük a Bikoken-nél [Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology of the Japanese Government (A Japán Kormány Fermentációs Kutatóintézete, Ipari Tudományos és Technológiai Ügynökség)], és ez a törzs a FERM BP-1069 letéti számot kapta 1986. 05. 27-én. A jelen találmány szerinti eljárás kivitelezéséhez tápközegként alkalmazhatunk mind szintetikus, mind szerves tápközegeket, amelyek megfelelő mennyiségben asszmilálható szénás nitrogénforrást, szervetlen anyagot és más olyan tápanyagokat tartalmaznak, amelyek a mikroorganizmusok növekedéséhez szükségesek. Az előnyös szénforrások között található pl. a glükóz, fruktóz, szorbit, glicerin, szacharóz, keményítő, keményítőhidrollzátum, melasz, gyümölcs-kivonatok, és különböző más szénhidrátok, ecetsav, fumársav, tejsav, maleinsav és különböző más' szerves savak, bár, ha kívánatos, lehet alkalmazni etanolt, metanolt és más alkoholokat Is. Az előnyös nitrogénforrások között található pl. az ammónia, ammónium-klorid, ammónium-szulfát, ammónlum-acetát, ammónium-foszfát és további különböző szervetlen savak ammónlum-sói, karbamid, aminok, és más nitrogén-tartalmú vegyületek, pepton, húskivonat, élesztőkivonat, kukoricalekvár, kazeinhidrolizátum, szójaliszt-hidrolizátum, fermentált mikroorganizmusok sejttömege és ezek hidrolizátumai, stb. Az előnyös szervetlen anyagokra példák lehetnek az alábbiak: kálium-monofoszfát, kálium-difoszfát, magnézium-foszfát, magnézium-szulfát, nátrlum-klorld, vas(ll)-szulfát, kalcium-karbonát, stb. A tápközeg, kívánt esetben, tartalmazhat megfelelő mennyiségben olyan tápanyagokat, amelyek az alkalmazott mikroorganizmusok növekedéséhez speciálisan szükségesek. Bizonyos esetekben ezek a tápanyagok jelen vannak a fentebb említett, természetben előforduló nitrogénforrásokban. Bizonyos esetekben az L-llzin termelékenység úgy is javítható, hogy a tápközegekhez bizonyos adalékokat adunk, pl. különböző antibiotikumokat, alfa-amino-tejsavat, ciszteint, leuclnt tartalmazó fermentlevet, aszparaglnsavat, glutamlnsavat és hasonlókat. A tenyésztést aerob körülmények között hajthatjuk végre, rázatással vagy szubmerz tenyésztéssel levegőztetés és rázatás mellett, általában 20°C—40"C hőmérsékleten, 3 és 9 közti pH tartományban (előnyösen semleges pH körül), bár a tenyésztést más körülmények közt is végre lehet hajtani, ahol a mikroorganizmus növekedni képes. A tápkőzeg pH-ját pl. kalcium-karbonát, karbamid, sav- vagy lúgoldat, stb. hozzáadásával, vagy pH szabályozóval lehet beállítani. A tenyésztést általában 1—6 napig folytatjuk, amely általában elegendő L-lizin képződésére és felgyülemlésére a tenyészközegben. Miután a tenyésztés teljessé vált, előnyös a mikroorganizmus sejttömeget és egyéb csapadékot eltávolítani a tenyészléből. Az L-llzint a felülúszóból hagyományos módon nyerjük ki, pl. ioncserélő gyantával való kezeléssel, koncentrálással, adszorpcióval, kisózással és hasonlókkal. Kívánt esetben az L-lizin a mikroorganizmus sejttömegétől is kinyerhető, hagyományos módon. A különböző kísérletek azt mutatták, hogy az L-lizin kitermelésében mintegy 10—25 % növekedés érhető el a Jelen találmány szerinti módszerrel. A következő példák, amelyek nem korlátozzák a találmány oltalmi körét, részletesebben bemutatják a jelen találmányt. 1. példa L-lizin-termelő és béta-naftokinon-rezlsztens Corynebacterlum glutamicum törzset [H-4412(FERM BP-1069)] kapunk a következő módon. Corynebacterlum glutamicum H-3149 törzset (FERM BP-158; természetben előforduló mikroorganizmus; tializin-rezisztens, rifampicin-rezisztens, streptomicln-rezisztens, és 6- azauracil-rezisztens), amelyet szülőtörzsként alkalmazunk, 0,1 n triszmaleinsav pufferolt oldatban (pH=6,0) szuszpendálunk 10® sejt/ml koncentrációban, ehhez N-metil-N’-nitro-N- nitrozo-guanidint adunk 0,2 mg/ml végső koncentrációig. A sejtszuszpenziót szobahőmér-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
