200796. lajstromszámú szabadalom • Eljárás E. coli kromoszómába történő nukleotid szekvencia beépítést biztosító expresszios vektorok előállítására
7 HU 200796 A 8 Ragadós végű DNS fragmentumok összekapcsolásakor a reakcióelegy (30—40 |J) 0,5—1,0 ^g DNS-t, 66mM Tris-HCI-t (pH 7,6), 5 mM MGCl2-ot, 5 mM dithiothreltolt, 1 mM ATP-t és 1 egység T4 indukált polinukleotid ligázt 5 tartalmazott. A ligálást 2—3 órán át, 14‘C-on végeztük [Maniatls T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. (1982) Molecular cloning, Cold Spring Harbor Lab., New York], Tompa végű fragmentumok összekapcsolása 30—40 p.g/ml DNS, 25 mM 10 Trls-HCI pH 7,4,5 mM MgCl2,5 mM dithiothreitol, 0,25 mM spermldin, 1 mM ATP, 10 (ig/ml BSA (Sigma, Type V) összetételű pufferben történt. A reakclóelegyhez 4—6 egység T4 Indukált polinukleotid ligázt adtunk, és 8—12 órán át 15 14°C-on Inkubáltuk. DNS minták gélelektroforézisét 0,8—2,0%os agaróz gélekben (Sigma, Type I), horizontális elektroforézis készülékekben a Helling és mtsai által leírt (1974) módon végeztük. A poliakril- 20 amid gélelektroforézis — 4 és 8%-os, 1 mm vastag, vertikális géleket alkalmazva — a Manlatis, T., Jeffrey, A. and van de Sande, H. (1975) [Chain length determination of small double and single-stranded DNS molecules by polyacryl- 25 amide gel electrophoresis. Biochemistry 14, 3787-3794] által közölt recept szerint történt. DNS fragmentumok izolálására agaróz és poliakrilamid gélekből Winberg G., Hammarskjöld, M. (1980) [Isolation of DNA from agarose 30 gels using DEAE-paper. Application to restriction site mapping of adenovirus type 16 DNA. NAR, 8, 253] DEAE papirt alkalmazó módszerét használtuk. BAL31 nukleázzal a DNS fragmentumokat 35 100 |xg/|j,l vógkoncentrációban, 600 mM NaCI, 12 mM CaCl2, 20 mM Tris-HCI (pH 8,0), 1,0 mM EDTA összetételű reakcióelegyben 30°C-on emésztettük. A megkívánt rövidítés mértékétől függően 1,0 jxg DNS-hez 0,4—1,2 egység en- 40 zimet adtunk. Minden esetben az adott DNS fragmentummal és a rendelkezésre álló BAL31 enzimpreparátummal teszt reakciót készítettünk, amelyben különböző idejű inkubálás után vett minták gélelektroforetikus analízisével 45 meghatároztuk a fragmentum megrövidülésének mértékét. Az enzim működését a reakcióelegy fenolos extrakciójával állítottuk le, és a DNS etanolos kicsapása után a végeket a 3' végek jelölésére alkalmas reakclókörülmé- 50 nyék között Klenow polimerlzálással tompa végekre javítottuk [Maniatls, T:, Fritsch, E.F., Sambrook, J. (1982) Molecular cloning, Cold Spring Harbor Lab., New York], Kompetens sejteket a JM107 baktériumtörzs transzformációjához a Mandel és Higa által közölt [Maniatls, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. (1982) Molecular cloning, Cold Spring Harbor Lab., New York] CaCl2-os eljárással készítettünk. DNS fragmentumok 5' végeinek defoszforilása. végjelölése polinukleotid kinázzal és of~3 r ATP-vel és a nukleotld szekvencia meghatározása a Maxam, A. and Gilbert, W. (1980) [Sequencing end-labeled DNA with basespecific chemical cleavages. Meth. Enzymol. 65 499—560] által leírt protokol szerint történik. A kromoszómális gén mutációját ún. „genom southern" technikával igazoltuk (Southern, E.: Detection of specific sequences among DNA fragmens separated by gel electrophoresis, J.Mol.Biol. 98:503, 1975). Az expressziós vektorok előállításához használt egyéb módszerek és eljárások alkalmazásakor a Maniatis T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. (1982) [Molecular cloning, Cold Spring Harbor Lab., New York] által leírt útmutatásokat követtük. Ábramagyarázat 1. ábra Az ábrázolt plazmid az Rí és R2 antibiotikum ellen egyaránt rezisztenciát biztosít, a Pr promoter egy kétcisztronos (a+Ri) m-RNS szintézisét vezérli. A (A/1; A12) — klónozott kromoszomális gén vagy egyéb kromoszómarészlet Rí — Saját promoter nélküli rezisztenciagón R2 — Saját promoterrel rendelkező rezisztenciagén Pr — promoter T — transzkripciós terminátor Őri — replikációs origó mRNS — messenger RNS 2. ábra Az ábrázolt plazmid csak az R2 antibiotikum ellen biztosít rezisztenciát. B — a kromoszómába integrálandó gén vagy egyéb szekvenciarészlet. T — transzkripciós terminátor szekvencia, melyen stoppolódik a Pr promoterről induló transzkripció 3. a és 3.b. ábra Az ábra a kettős rekombinációs eseményt és következményeit vázolja. A jelölések azonosak az előzőekkel. Deponálási adatok: Deponált törzs Jele Deponálási szám Deponálás dátuma IM 107 /pER 23“C”L1 IM 107 /pER 23“C"L1TiT2 NCAIM B (P) 001061 NCAIM B (P) 001061 1988.JÚI.13. 8 ó. 50 perc 1988JÚI.13. 8 ó. 50 perc 5
