200796. lajstromszámú szabadalom • Eljárás E. coli kromoszómába történő nukleotid szekvencia beépítést biztosító expresszios vektorok előállítására
1 HU 200796 A A találmány tárgya eljárás tetszőleges nukleotid szekvenciának E. coli kromoszómába történő beépítését, továbbá az átalakított E. coll kromoszómát tartalmazó kiónok egyszerű elkülönítését biztosító plazmidok előállítására. A találmány tárgyát képező eljárással előállított plazmidok (expressziós vektorok) rendkívüli mértékben megkönnyítik egy tetszőleges DNS fragmentum beépítését a hordozó sejt kromoszóma állományának valamely kiválasztott génjébe. A DNS fragmentum beépüléskor a kromoszómán lévő gén azonnal inaktiválódik. A módszer a baktóriumsejt homológ rekombinációs mechanizmusán alapszik, és fő előnye, hogy segítségével olyan pozitív szelekciós rendszer hozható létre, amely lehetővé teszi 107~ 108 baktóriumsejt egyidejű tesztelését, és a létrehozni kívánt rekombináns klón azonnali kiválasztását. A kromoszómán lévő gének inaktiválására szolgáló ismert módszer szintén a homológ rekombináción alapul (Ruvkun, G.B. et. al.: A general method for site-directed mutagenezis in prokaryotes, Nature 289:85, 1981; Lee, C.A. et. al.: Used of cloned mtl genes of Escherichia coli to introduce mtl deletion mutations into the chromosome, J. Bact. 153:685, 1983; Jasin, M. et. al.: Deletion of an essential gene in Escherichia coli by site-specific recimbination with linear DNA fragments, J. Bact. 159:783, 1984; Wirans, S.C. et. al.: Site directed insertation and deletion mutagenezis with cloned fragments in Escherichia coli, J. Bact. 161:1219,1985) azonban lényegesen idő- és anyagigényesebb, mint a találmány szerinti eljárás. Az ismert módszer szerint először az elrontandó gént egy antibiotikumra rezisztens (továbbiakban Rí rezisztencia) plazmidba klónozták, majd a gén plazmidon kódolt kópiájába egy másik antibiotikum rezisztencia (továbbiakban R2 rezisztencia) gént tartalmazó DNS darabot — általában Tn5 transzpozont — építettek be. Ezután transzformálták a sejtet egy további, az előző plazmiddal szemben inkompatibilis plazmiddal, amely egy harmadik rezisztencia (továbbiakban R3) gént hordozott. A transzformált sejteket R2, R3 antibiotikum keverékén növesztve, és az egyedi telepeket Rí antibiotikum rezisztenciára tesztelve R2, R3 rezisztens, Rí szenzitív kiónokat lehetett izolálni, amelyek között voltak a keresett rekombinánsok. Ezzel a módszerrel már néhány ezer klón átvizsgálása is rendkívül időigényes. Ráadásul amennyiben az inaktiválandó gén esszenciális a baktérium számára, abban az esetben ez a megközelítés csak egy kibővített formában alkalmazható. Nevezetesen a génnek egy ép, működő kópiája kell hogy jelen legyen a sejtben. Ez legegyszerűbben egy további, a másodikkal kompatibilis plazmidon vihető be, viszont ekkor a plazmidon lévő génkópia szintén szerepelhet a kettős rekombináció célpontjaként. Ilyen esetben nagyszámú hamis pozitív klón közül kell kiválasztanunk a megfelelőt, ami még anyag- és időigényesebbé teszi az eljárást. Találmányunk szerinti megoldást idegen géneknek kromoszómába való bejuttatására is használhatjuk. Ezt eddig lizogén fág alapú expressziós vektorok (Molecular cloning of the T4 genome — organization and expiration of the FRD-DNA ligase region, Mol.Gen.Genet. 179(2):227-239, 1980) segítségével oldották meg. Ezek alkalmazásánál nem választhatjuk meg önkényesen a beépítés helyét, erősen korlátozottak e lehetőségeink. Az eddig ismert módszerek során — amenynyiben az integráláshoz szintén a homológ rekombinációt használták fel — a mi módszerünktől eltérően a kívánt rekombinánst csak komoly nehézségek árán lehetett szelektálni, illetve az integráció a kromoszóma bizonyos pontjaira nem is volt lehetséges. Célkitűzésünk az volt, hogy olyan rendszert dolgozzunk ki, melynek segítségével lényegesen egyszerűsödik a megfelelően átalakított (rekombináns) kromoszómát tartalmazó kiónok kiválasztása, továbbá a kromoszómaállomány tetszőleges részén tudunk változásokat végrehajtani. A fenti problémát egy új plazmidkonstrukció kidolgozásával sikerült megoldani. A találmány tárgya tehát eljárás tetszőleges nukleotid szekvencia E.coli kromoszómába történő beépítését, illetve az átalakított E. coli kromoszómát tartalmazó klónok. egyszerű elkülönítését biztosító plazmidok előállítására — a plazmidok kialakítása során a génsebészet önmagában ismert módszereit alkalmazva —, amely abban áll, hogy valamely idegen gén kifejezésére alkalmas transzkripciós szabályozó szekvenciákat, továbbá ezen szabályozó szekvenciáktól függetlenül kifejeződő rezisztenciagént (továbbiakban R2) tartalmazó plazmidba az idegen gének kifejezésére alkalmas transzkripciós szabályzó szekvenciák közé az E. coli hordozó sejt egy kromoszómarészletének megfelelő kromoszómarészlet-kópiát, majd ettől downstream irányban egy R2-től különböző, saját promoter nélküli rezisztencia gént (továbbiakban Rí) építünk be, végül a beépített kromoszómarészlet-kópiába egy olyan szekvenciarészletet iktatunk be, amely minimálisan egy transzkripciós terminátort tartalmaz. A találmány szerinti plazmidok segítségével könnyen végrehajhatjuk a kívánt kromoszómaátalakítást, és az átalakított kromoszómát tartalmazó kiónokat egyszerűen elkülöníthetjük, oly módon, hogy a találmány szerinti plazmidot tartalmazó sejtekből indított kiónokat 10—20 órán keresztül az R2 génnek megfelelő antibiotikumot tartalmazó táptalajon növesztjük, majd a kinőtt egyedeket ezt követően az Rí génnek megfelelő antibiotikumot tartalmazó táptalajra szélesztjük, végül az életben maradt kiónokat elválasztjuk és tovább tenyésztjük. 2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
