200795. lajstromszámú szabadalom • Eljárás többszörös horgokat tartalmazó plazminogén aktivátorok előállítására
25 HU 200795 B 26 Biokémiai jellemzés BPV-I-alapú kifejeződő vektor rendszerben való kifejeződéshez. Ezeket a h-PA-kat a továbbiakban A Hibrid-ként, illetve B Hibridként nevezzük. A BamHI-vel szegélyezett komplett gén-. -szekvenciákat A Hibridhez (1,8 Kb, 5. ábra) és B Hibridhez (2,0 Kb, 7. ábra) BglII-vel hasított p341-3 plazmidba iktattuk (a részletekkel kapcsolatban lásd: Anyagok és Módszerek). 12 rekombináns klónból mini-plazmid készítményt állítottunk elő, és ezt egyenként emésztettük Narl-el, BglII-vel agy BamHI-vel, és Aval-el. Ezt azért végeztük el, hogy igazoljuk a hibrid gének' jelenlétét, valamint meghatározzuk a beiktatás orientációját. A génnek csak egy orientációja (a metallotionein promoternak az irányában) kívánatos, mivel ez helyezi a' gén kifejeződését ennek a promotornak az ellenőrzése alá. Ezen túl, az éppen a gén mögött elhelyezkedő SV40 poli-A szekvencia a gén RNS-átirását úgy irányítja, hogy a gén 3’ végének poliadenilezésével a gén hatásos transzlációja menjen végbe. Két rekombináns kiónt (pHyb AMT-43, az A Hibridhez, és pHyb BMT-50, a B Hibridhez) kaptunk. Mintegy 1 /ug> a fentebb említett klónokból nyert plazmid DNS-t emésztettünk BamHI-vel, majd az így nyert terméket defoszforileztük bakteriális alkalikus foszfatázzal. Ebbe iktattunk be egy teljes, 8,0 Kb-s, BamHI-vel hasított BPV-I genomot. Két kifejeződő plazmidot, a pHyb-AMTBPV-438-at és a pHyb-BMTBPV-504-et (ezeket később röviden p438-nak és p504-nek nevezzük) kaptunk, amelyek az A Hibridet, illetve B Hibridet kódoló géneket tartalmazzák. A kifejeződő plazmidok teljes térképét, amely a különböző komponensek relatív elhelyezkedését is bemutatja, a 14. ábrán ábrázoljuk. A hibrid t-PA/urokináz molekulát kódoló géneket tartalmazó két kifejeződő plazmidot egér C127 sejtekbe juttatjuk kalciumfoszfát kicsapásos módszerrel [Graham és munkatársai: Virology, 52, 456 (1973)]. Morfológiailag transzformált sejtek gócaiból altenyészeteket készítettünk, és átvizsgáltuk ezeket gén-kifejeződésre. A tápközeg kezdeti átvizsgálását fibrinolitikus aktivitásra fibrin-agar lemezen végeztük, amint ezt a 15(a) ábrán bemutatjuk [Plong és munkatársai: Biochem. Biophys. Acta, 24, 278 (1957)]. Az egyes fertőzésekből a p504-el (B Hibrid) transzformált gócok átlagosan 50%-a, és a p438-al (A Hibrid) transzformált gócok 5%-a mutatott pozitív fibrinolitikus aktivitást a tenyészközegben. Több nagy termelőt választottunk ki, és sejtvonalakat fejlesztettünk ki az egyes gócokból. A két sejtvonalat, amelyekkel a géntermékek előzetes biokémiai és immunológiai jellemzésének többségét elvégeztük, 5A5 klónként (B Hibrid), illetve 16C1 klónként (A Hibridnek) nevezzük. A hibrid molekulák enzimatikus aktivitásait fibrin-agar méréssel és amidolitikus méréssel határoztuk meg, S-2444 és S-2251 szintetikus szubsztrátumokat alkalmazva [Shimoda és munkatársai: Thromb. Haemostas. 46, 507 (1981)]. Mintegy 1-5 egység/jul aktív enzim választódott ki a tápközegbe 16-18 óra alatt. Természetes t-PA és urokináz szintetizálódott, mint prekurzor, és választódott ki a sejtekből, miután a szignál szekvencia lehasadt, hogy érett fehérje alakuljon ki. Ezen kívül mind a t-PA, mind az urokináz glikozileződótt. Hogy meghatározzuk, vajon a fertőzött egérsejtek által kiválasztott h-PA-k hasonló módon alakulnak-e ki, mint a temészetes t-PA és az urokináz, a hibrid molekulákat SDS/poliakrilamid gél (PAGE) elektroforézissel elemeztük, amelyet fibrin-agaros felülrétegezés követett [Granelli-Piper no és munkatársai: J. Exp. Med. 148, 223 (1978)]. Amint a 15(b) ábrán látható, a B Hibridet tartalmazó tápközegből nyert aktív enzim 76000 molekulatömegű, míg az A • Hibridet tartalmazó tápközegből nyert aktív enzim 71000 molekulatömegű. Ezek az adatok jó' egyezésben vannak a beiktatott génből kalkulált molekulatömeggel. A B Hibridet a kinyert tápközegből hasonló módon tisztítottuk, mint amelyet a t-PA tisztításnál alkalmaztunk. Az aminosav szekvencia elemzés azt jelzi, hogy a B Hibrid N-terminálisa korrekt módon alakult ki, az érett t-PA N-terminális területével azonos szekvenciával (Ser-Tyr-Gln-) rendelkezik; ezen kívül egy Ile-Lys-Gly-N-terminális, amely az Arg-Ile aktivációs hasítási helynél levő aminosavaknak felel meg, is jelen van. Arra a következtetésre lehet jutni, hogy £ kinyert tápközegből tisztított B Hibrid főleg aktivált, kétláncos formában létezik. Ha proteáz inhibitor (Aprotinin) adunk a kinyert tápközeghez, egy egyláncos h-PA molekulát nyerünk. A 35S-jelzett kinyert tápközeg immun-kicsapása, amelyet SDS/PAGE követ, azt mutatta, hogy nem redukáló körülmények között egy 71000-76000 látszólagos molekulatömegnek megfelelő helyzetnél csík figyelhető meg az 5A5 (B Hibrid), illetve 16C1 (A Hibrid) sejtvonalakból származó mintákban, a kontroll mintákban viszont nem. Az 5A5 sejtekből származó tápközeg, valamint . a tisztított t-PA (American Diagnostics, Inc., Greenwich, Connecticut) fibrinolitikus aktivitását anti-t-PA antiszérum semlegesített, de az anti-urokináz antiszérum nem, ez a jelenség azt sugallja, hogy bár a B Hibrid tartalmaz egy urokináz horgot a t-PA-n kívül, a Hibrid B proteáz-terét az anti-t-PA ismeri fel és semlegesíti. Anti-urokináz antitest kötődhet a hibrid 'molekula urokináz horog-területéhez, de ez a kötés, ha egyáltalán létezik, nem avatkozik be a hibrid-molekula C-terminálisánál levő 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 15
