200794. lajstromszámú szabadalom • Eljárás malária antigének kifejezésére
7 HU 200794 B in vitro átfordítással jellemezve. Egy frakciód amelyről úgy találjuk, hogy kódolja a P.195-őt, radioaktívvá teszünk korlátozott alkalikus hidrolízis után, polinukleotid kinázzal és K32P-ATP-vel. Ezt a vizsgáló mintát alkal- 5 mazva telep-hibridizálási kísérletben, számos kiónról találjuk azt, hogy hibridizálódik ehhez, néhány közülük erősen. Ezeket azután kereszthibridizálással családokba osztályozzuk, és minden családból egyet radioaktívvá 10 teszünk DNS polimerázzal és c(-32P-dATP-vel végzett bemetsző (nick)-átforditással. Ezekről a vizsgáló mintákról feltételezve, hogy a P. 195-höz való DNS szekvencia részeit képviselik, ezeket egy nem kisebb, mint 5300 bá- 15 zis hosszú mRNS-hez hibridizálhatjuk a P. fulciparum in RNS teljes extraktumában, mivel i'z n 195 000 iiiolckiilutöini'gij fehérje kódolásához szükséges becsüli, legkisebb iiiRNS- hossz. 20 A vizsgáló mintákat, amelyek felismerik az ilyen mRNS-t (Northern folt eljárás) azután tovább jellemezzük egy vektorba beépítve, amely egy megfelelő gazdaszervezetben képes a cDNS szekvenciát kifejezni, mint 25 egyesített peptidet. Hogy biztosítsuk ennek a cDNS-nek a kifejeződését, a fragmenseket exonukleázzal kezeljük a vektorba való beépítés előtt abból a célból, hogy véletlenszerű olvasókereteket adjunk. A kifejezett pép- 30 tideket P.195 ellen készített polivalens nyúlszérummal vizsgáljuk. A fentebb idézett DNS fragmenseket ilyen eljárással mutatjuk ki. A P. 195-hez való teljes hosszú cDNS klónozását illetően rendelkezésre áll számos 35 módszer a cDNS szintéziséhez a teljes mRNS megjelenítésére (pl. Heidecker, G. és Messing, J.: Nucleic Acid Res. 11, 4891-4906 /1983/). A klónozást végre lehet hajtani a teljes genom DNS emésztés .könyvtár ’-ának alkalmazásé- 40 val, amelyet könnyen el lehet készíteni, és a szóban forgó szekvenciát vagy annak fragmenseit ki lehet mutatni egy. ilyen .könyvtáriban a fentebb leirt fragmensnek, mint .vizsgáló mintá‘-nak alkalmazásával (pl. 45 Odink, K. G. és munkatársai: Mól. Biochem. Parasitol. 10, 55-66 /1984/). Az ezzel a technikával talált szekvenciák egy hányada lehet teljes hosszúságú cDNS szekvencia, ha szükséges, bár több lehet az ilyen szekven- 50 cia fragmenseiból. Abból a célból, hogy meghatározzuk milyen kiónok képviselik a .könyvtár'-ban a kívánt szekvencia DNS egy részét, egy .kromoszóma sétálás'-ként ismert módszert (Hadfield, C.: Focus, 5, 1-5 /1983/, 55 Bethesda Rés. Labs.) lehet alkalmazni, amely módszer magával vonja az ismert fragmensek (vizsgáló minták) alkalmazását, hogy kimutassunk más fragmenseket kereszthibridizálással. Ezeket a frissen elhelyezett szekvenciá- 60 kát lehet azután önmagukban alkalmazni, mint vizsgáló mintákat és ilyen módon a lényegében P.Í95-ÖL kódoló teljes DNS szekvenciát azonosíthatjuk és klónozhatjuk. Az ilyen eljárást alkalmazva a DNS szekvenciára 65 jellemző restrikciós térképet is el lehet készíteni. A P.195-hőz tartozó gén fizikai térképének elkészítése a genom DNS-ben restrikciós endonukleáz hasítással, gél-elektroforézissel, nitrocellulóz vagy poliamid membránokra átvitellel és klónozott DNS-ből származó fajlagos vizsgáló mintákra való hibridizálással különösen hasznos a cDNS és genom kiónok orientációjának és helyzetének bizonyítására és ennek megkönnyítésére. Ezen kívül a restrikciós helyek összehasonlítását a cDNS kiónokon belül a restrikciós helyekkel a genomon belül fel lehet használni azoknak a géneknek a jellemvonásainak a kimutatására, amelyek nem lehetnek jelen abban az mRNS-bert, amelyből a cDNS-t szintetizáltuk. Egy ilyen példa lehetne megszakítások, vagyis intronok jelenléte u kódoló szekvencián belül, amelyeket össze lehet .toldani* az átirt RNS-böl fajlagos összetoldó műveletekkel. Egy ilyen lehetséges mintegy 700 bp-s intront lehet elhelyezni a fenti technikákkal a kódoló szekvencia 221 és 313 nukleotidjai közé (1. ábra), vagyis az ezeknél a helyzeteknél levő Mbol (M) és HindlII helyek közé. (3. ábra) Amint fentebb jeleztük, a P.195 in vivo elkülönült fragmensekké dolgozódik fel, beleértve a fentebb említett fragmenseket, Ezek a fragmensek jelentős értékűnek bizonyulhatnak a malária elleni immunitás szolgáltatásában, és az ilyen fragmensekhez tartozó DNS szekvenciák a jelen találmány egyik fontos megtestesülését jelentik, főleg azért, mert az ilyen szekvenciák általában valószínűleg jobban képesek a kifejeződésre a megfelelő vektorokban, mint a teljes fehérjéhez alkalmas DNS szekvenciák. így a jelen találmány egy másik szempontja szerint lényegében az in vivo előforduló P.195 fragmensek valamelyikét kódoló klónozott DNS szekvenciát szolgáltatunk. A természetben előforduló P.195-nek a fragmensei, amelyek legvalószínűbb, hogy immunválaszt váltanak ki egy fogékony gazdaszervezetben, azok, amelyek a merozoita felületen jelen vannak. A jelen találmány egy még további szempontja szerint lényegében a P. falciparum felületi membránon in vivo előforduló P.195 fragmensek valamelyikét kódoló klónozott DNS szekvenciát szolgáltatunk. Hogy a feldolgozás alatt álló fragmensek helyzetét behatároljuk (Holder és Freeman /1984 b/, fentebb idézett munka) a lineáris génszekvenciában, egyik direkt megközelítés a fragmensek tisztítása és a részleges aminosav szekvencia meghatározása, amelyet azután össze lehet hasonlítani az átfordított gén-szekvenciával. Ez megvalósíthatónak bizonyult a 83 000 molekulatömegű fragmensnél, amely, úgy tűnik, fajlagosan válik le a merozoitából, valószínűleg a vörösvérsejt megtámadásának folyamata során, és az in vitro tenyészetek felülúszójában gyűlik Ösz-8 6
