200794. lajstromszámú szabadalom • Eljárás malária antigének kifejezésére
29 HU 200794 B 10. példa Az E. coli-ban termelt fúziós fehérjék antigenicitésán’ak és immunogenicitésának elemzése P. 195-ből származó, P. falciparumra fajlagos nyúl polivalenB antiszérumot nyerünk egy nyulat immunizálva 100 ug fehérjével Freund-féle komplett adjuvánsban (FCA, Difco Laboratories, Detroit), majd emlékeztető oltásokat adva 100 pg fehérjével Freund-féle inkomplett adjuvánsban (FIA) a 22., 43., és 211. napokon. A 218. napon az első immunizálástól számitva a szérumot összegyűjtjük. Polivalens antiszérumot a tisztított- fúziós fehérjével végzett immunizálással állítunk elő (8. példa). Nyulakat immunizálunk szubkután 250 Mg fehérjével FCA-ban, majd emlékeztető oltásokat adunk 250 pg fehérjével FIA-val a 21. napon. A 35. napon az elsődleges immunizálás után mintákat gyűjtünk össze. Egereket immunizálunk intraperitoneálisan 125 Mg fehérjével FCA-ban és azonos dózisú emlékeztető oltást adunk a 23. napon. A 30. napon az elsődleges immunizálástól számitva szérum mintákat gyűjtünk. Egy antiszérum titrálását az antitesek kötődésére a fehérjéhez mennyiségileg szilárd fázisú radioimmunassay-val (RIA) lehet elvégezni, amelyben a mikrotitráló lemez üregeit a fehérjével borítjuk be, majd az antitest-oldat sorozat-higitásait adjuk az üregek sorozataihoz. A nem kötött antitestek kimosása után a kötött antitesteket kimutatjuk az első antitestekre fajlagos, nagy mértékben jelzett reagenseket alkalmazva, pl. az első antitestekre fajlagos, affinitással tisztított IgG Staphylococcus aureus eredetű Protein A-ját alkalmazva. Az a fehérje, amellyel a mikrotitráló lemezek be vannak borítva, vagy az E.coli lizátumaiból tisztított fúziós fehérje, amint ezt a 8. példában leirtuk, vagy a P. falciparummal fertőzött vörös vérsejtek extrák tu maiból monoklonális antitest affinitás-kromatográf iával tisztított P.195, ahogyan ezt Holder és Freeman leírták (1984 b, fentebb idézett munka). Az antigéneket 20 Mg/ml-re hígítjuk 0,05 mól/literes NaHCOí-ban (pH 9,6), és ebből az oldatból 50 pl-t adunk egy 96 üreges PVC mikrotitráló lemez (Dynatech Laboratories) minden egyes üregébe. 90 perc után a lemezt alaposan átmossuk foszfáttal pufferolt' fiziológiás sóoldattal, amely 0,5% (térf./térf.) Tween 40-el és 0,2% (tómeg/térf.) bovin szérum albuminnal van kiegészítve (mosó puffer). 50 1-t minden egyes szérum-hígításból két példányban adunk az üregekbe és 30 perc után a lemezeket 10 percen át mossuk mosó pufferban. A fajlagos antitestet 50 m1* «sj-vel jelzett Protein A (1,5 • 105 cpm) hozzáadásával mutatjuk ki, amelyet élénk mosás és a kötött radioaktivitás meghatározása követ, Packard PED gamma számlálót alkalmazva. Amint az 1. táblázatból látható, a P.195 szekvenciákat tartalmazó fúziós fehérjékkel immunizált nyulak olyan antitesteket termelnek, amelyek reagálnak a tisztított P.195-el a RIA-vizsgálatbanLés a P.195 elleni polivalens antiszérum olyan antitesteket tartalmaz, amelyek reagálnak a fúziós fehérjékkel. Ebben az esetben az 1. fúziós fehérje a pPFcl028 trpE-be iktatott EcoRI-Ndel fragmensének terméke, míg a 2. fúziós fehérje a pPFcl028 trpE-be iktatott EcoRI-HindlII fragmensének terméke. A 8. példában bemutattuk, hogy a fúziós fehérje reagál a polivalens anti-P.195 antiszérumban levő antitestekkel Western-foltképzésben. A feldolgozódó fragmensek helyzetét a lineáris kódoló szekvenciában részlegesen meghatározzuk a “S-metioninnal jelzett P. falciparum detergens-extraktumából (7, példa) végzett immunológiai kicsapással. Amikor a fúziós fehérjék elleni antiszérumokat alkalmazzuk a fehérjék immunológiai kicsapásához ebből az extraktumból, a P.195-öt minden esetben felismerjük. Ezen kívül a pPFcl028 EcoRI-Ndel beiktatott rész által kódolt fehérje ellen kialakított nyúl antiszérum reagál túlnyomórészt a 153 000 ób 29 000 molekulatömegű fragmensekkel is. A pPFcl028 EcoRI-HindlII beiktatott rész ellen kialakított nyúl antiszérum reagál túlnyomórészt a 42 000 molekulatömegű fragmens ellen is. 30 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 17
