200794. lajstromszámú szabadalom • Eljárás malária antigének kifejezésére
25 HU 200794 B 26 mer, mig a 111.2 antitest nem, a kódoló szekvencia amino-terminálásának 78,5%-éból származik, és ennél fogva magában foglalja a 83 000 molekulatömegül fragmens egészét. A 42 000 molekulatömegül fragmens a kódoló szekvencia karboxi-terminálisának 21,5%-ából származik, mivel a 111.2 antitest nem reagál a 153 000 molekulatömegű fragmenssel. A 19 000 molekulatömegű fragmens valószínűleg a 153 000 molekulatömegű fragraensen belül helyezkedik el, de nem a 83 000 molekulatömegü fragmensen belül. 8. példa A P.195 szekvenciák kifejeződése fúziós fehérjeként E. coliban, és a termékek tisztítása Egy külön kísérletben pWRL507-et (a mellékelt ábrák közül a 4. ábra) emésztünk Ndel-el és EcoRI-el, EcoRI-el és BamHI-el, vagy EcoRI-el és Hindlll-al, és a megfelelő fragmenseket agaróz gél elektroforézissel tisztítjuk. Ezt a DNS-t (0,1 pikomól) ligáljuk 0,5 pikomól, P.195 rekombinánsokból származó DNS fragmensekkel a restrikciós enzimek megfelelő párjaival, majd DH1 (Hanahan, D. és mtársai, J. Mól. Bioi. 166, 557-580) sejtek transzformálására használjuk ezeket ampicillin rezisztenciára. Telepeket vizsgálunk át kis plazmid készítmények restrikciós enzimes emésztésével. A beiktatást tartalmazó plazmidokkal rendelkező törzseket tovább növesztjük M9 minimál tápközegen, amely 100 Mg/ml ampicillint és 10 Mg/ml indol-akrilsavat (indukált kifejeződés) vagy 100 Mg/ml ampicillint és 10 Mg/ml triptofánt (nem-indukált kifejeződés) tartalmaz. Baktériumokat nyerünk ki centrifugálással 10 000 g-nál 1 percen, át, majd PAGE-hez szolgáló SDS minta betápláló puffer hozzáadásával lizáljuk {62,5 mmól/liter Tris-HCl (pH 6,8), amely 2% (súly/térfogat) nátrium-dodecil-szulfátot, 10% (térf./térf.) glicerint, 0,1 mól/liter ditiotreitolt és 0,005% (súly/térfogat) brómfenolkéket tartalmaz}. Alikvotokat vetünk alá SDS-PAGE analízisnek, majd a géleket coomassie kékkel megfestjük, hogy kimutassuk a teljes fehérjét vagy elbontott fehérjét, és ezeket átvisszük nitrocellulózra és felhasználjuk Western foltképzésre a tisztított P.195 ellen kialakított polivalens antiszérummal. A pPFgl-nek Ndel-EcoRl fragmensét tartalmazó törzs egy 135 000 molekulatömegű indukálható fúziós fehérjét termel, amelyet ki lehet mutatni a lizátumokban coomassie kék-festéssel és a polivalens antiszérummal való reakcióval. Ez megfelel a trpE gén-termék N-terminálisáról származó 233 aminosavat és a P.195-bői származó 907 aminosavat tartalmazó fúziós fehérjének. A pPFcl028 EcoRl-BamHI fragmensét tartalmazó törzs egy 53 000 molekulatömegű fúziós fehérjét termel, amely trpE-ből szár■ 326 aminosavat és a P. 195-ből származó kapcsoló-szakaszt (linkért) és 156 aminosavat tartalmaz. A pPFcl028 EcoRI-HindlII fragmensét tartalmazó törzs egy 105 000 molekulatömegű fúziós fehérjét termel, amely trpE-ből származó 326 aminosavat és P. 195-ből származó kapcsoló-szakaszt (linkért) és 594 aminosavat tartalmaz. A pPFcl028-ból származó EcoRI-Ndel fragmenst tartalmazó törzs egy 85 000 molekulatömegű fúziós fehérjét tarmel, amely trpE-ből származó 326 aminosavat és P.195-ből származó 401 aminosavat tartalmaz. A fúziós fehérjét minden esetben coomassie kékfestéssel és polivalens anti-P.195-szérummal Western foltképzéssel végzett reakcióval határozzuk meg. A pPFcl013 klón cDNS-éből származó, 750 bp-s Rsal-HindlII- fragmenst, amely a 863-1613 nukleotidokat tartalmazza a G-C farokkal együtt és a pUC9 polilinker terület egy részét a PstI helytől a HindlII helyig, pUC9 plazmidba szubklónozzuk, amelyet előzőleg HindlI-vel elhasitottunk, borjúbél foszfatázzal kezeljük és tovább emésztjük HindIII-al. A beiktatott részt ezután kivágjuk a pUC9-ből EcoRI-et és HlndIII-at használva és beiktatjuk (helyes orientációban) EcoRI-el és HindIII-al hasított pWRL507-be. Hogy kereten belüli kifejeződést nyerjünk, 5 Mg plazmidot kezelünk EcoRI restrikciós enzimmel, igy linearizáljuk a készítményt. A DNS-t etanollal kicsapjuk, 50 m1 vízben (amely 500 Mg/ml _BSA-t is tartalmaz) újra feloldjuk, majd összekeverjük egyenlő térfogatú Bal 31 pufferral (Maniatis és munkatársai, 1982, fentebb idézett munka). A DNS-t 0,02 egység Bal 31 enzimmel (Biolabs) 1 percen át emésztjük 30 °C hőmérsékleten, majd a reakciót 20 m1 1 mól/liter EDTA-t és 100 mmól/liter EGTA-t tartalmazó oldat hozzáadásával leállítjuk. A DNS-t agaróz-gél elektroforézissel tisztítjuk, majd DNS polimeráz 1 nagy fragmenssel (Klenow) kezeljük nukleotid-trifoszfátok jelenlétében, 2,5 egység enzimet (Boehringer/Mannheim) alkalmazva 50 m1 nick-transzlációs puffer végső térfogatban (Maniatis és munkatársai, 1982, fentebb idézett munka) 90 percen át szobahőmérsékleten. A DNS-t (0,1- pikomól) azután újra kör alakúvá tesszük egy éjszakán át 200 egység T4 DNS ligázzal (Biolabs) 7 °C hőmérsékleten végzett inkubálással, majd DH1 sejtek transzformálásához használjuk fel ampicillin-rezisztenciára. Tiz egyedi transzformáit sejtet vizsgálunk át a plazmid DNS restrikciós enzimes elemzésével. Egy 8 transzformánsból álló csoport tartalmaz olyan plazmidot, amely elvesztette az EcoRI helyet. Ezt a csoportot tovább elemezzük M9 tápközegben növesztve indol-akrilsav vagy triptofán jelenlétében. Egy törzs állít elő egy mintegy 65 000 molekulatömegű fúziós fehérjét, amikor indol-akrilsav jelenlétében növesztjük, é6 ez a fúziós fehérje reagál polivalens anti-P.195 szérummal Western-foltképzéssel. 5 10 15 XI) 25 30 35 40 45 50 55 60 65 15
