200793. lajstromszámú szabadalom • Génsebészeti eljárás új, humán interleukin-2-fehérje előállítására
19 HU 200793 B egér sejtvonalba (NKC3, lásd 7. ábra), valamint egy IL-2-függö emberi sejtvonalba (lásd 8. ábra). Ezen kivül az IL-2 fehérjét 20% FCS-el kiegészített RPMI 1640 tápközegben oldunk 0,5 egység/ml koncentrációra, és 2 x x 105 sejt/ml NKC3 sejtvonalat szuszpendálunk el a tápközegben. Tenyésztést folytatunk Limbro Multi lemezen (Flow, Amerikai Egyesült Államok) 37 °C hőmérsékleten 5% CO2 jelenlétében, miközben az élősejt számlálást és a tenyészet újra szuszpendálását friss tápközegben megismételjük 2-3 naponként. Ennek eredményeképpen azt találjuk, hogy az említett IL-2 fehérjének van aktivitása az NKC3 sejtvonal növekedésének fenntartására hosszú időn át, amint ez a 9. ábrán látható. 2. példa. (Injekció készitése) Az 1. példa IV. része szerint nyert nem glikozilezett humán IL-2 fehérjét tartalmazó oldatot alkalmazzuk 0,025 mól/liter ammónium-acetát pufferral (pH 5,0) kiegyensúlyozott CM Toyopearl (Toyo Sóda, Japán) oszlophoz, az adszorpciót aszeptikus körülmények között végezve, majd ezt követi az elúció a fenti pufferral, amely még 0,15 mól/liter NaC)-t is tartalmaz. Az eluátumot megfelelő mennyiségű 0,15 mól/literes NaCl-el hígítjuk, majd HSÁ-t adunk hozzá 0,5% koncentrációig, és a keveréket membránszűrőn (0,22 um pórus-átmérő) étszűrjük. A szűrletet aszeptikusán 1 ml-es adagokban ampullákba osztjuk szét, ezt követi a liofilezés. A humán IL-2 injekciós készítményt ampullánként 1 ml desztillált vízben oldjuk fel injekcióhoz használat előtt. Az IL-2 készítmények endotoxin tartalmának és pirogenecitásának meghatározásához két tétel tisztított IL-2-t állítunk elő E. coli sejtekből a találmány szerinti eljárással, és két tétel nyers extraktumot, vagyis sejtmentes extraktumot állítunk élő E. coli sejtekből a 91 539. számú európai közrebocsátási irat szerint. A minták előállításét az I. kísérletben ismertetjük. Az így kapott két tétel nyers extraktumot és két tétel tisztított készítményt használjuk a II. kísérletben ismertetett endotoxin meghatározáshoz és pirogén teszthez. (1) Endotoxin tartalom Mint a II. kísérlet 7. táblázatából látható, a tisztított készítmény endotoxin tartalma különösen alacsony, közelebbről 0,017 és 0,014 ng/mg fehérje. Ezzel ellentétben a nyers extraktum endotoxin tartalma mintegy 1,6 x 105-szerese a tisztított készítményének, vagyis konkrétan 2,0 x 103 és 2,9 x 103 ng/ mg fehérje. Mivel a nyers extraktum endotoxin ' tartalma túl nagy, az extraktum klinikai célokra nem használható, míg a különösen kevés endotoxint tartalmazó tisztított készítmény klinikai felhasználásra önmagában alkalmas. 20 (2) Pirogén teszt Az egyedenként 1 x 103 egység értékű klinikai dózisból kiindulva (ami 50 kg átlagos testtömeg figyelembevételével megfelel 20 egység/kg dózisnak), pirogén tesztet hajtunk végre mindkét készítmény tízszeres, vagyis 200 egység/kg dózisú adagolásával. A dózis meghatározó kísérletben azonban a nyers extraktummal kezelt nyulak a testhőmérséklet emelkedése miatt elpusztultak. Ezért a nyers extraktum dózisát 20 egység/ kg értékre csökkentjük. Mint a II. kísérlet 8. táblázatából látható, a tisztított készítmény adagolása esetén pirogenecitás nem mutatható ki, míg a nyers extraktum esetén a jóval kisebb dózisban alkalmazott rIL-2-nél is pirogenecitás észlelhető. , A nyers extraktum tehát pirogenecitésa miatt klinikai felhasználásra nem alkalmsa, míg a tisztított készítmény klinikai célokra felhasználható. I. kísérlet (1) E. coli N4830/pTB 285 előállítása Az 1. referencia példa szerint előállítottpilot 135-8 plazmidot HgiAI restrikciós enzimmel hasítjuk. Így így kapott 1294 bp DNS fragmenst T4 DNS fragraens polimerázzal tompa végűvé alakítjuk és T4 DNS ligáz felhasználásával dRGCCATGAATTCATGGCA Eco?I linkerrel kapcsoljuk. Az igy kapott DNS-t EcoRI segítségével hasítva olyan DNS fragmenst kapunk, amely többek között ATG start kodont és humán IL-2 gént tartalmaz. Ezt a DNS fragmenst T4 DNS ligáz segítségével EcoRI-PstI helyen hasított ptrp 781-be (Nucleic Acid Research 11, 3077, 1983) építjük be. Az így. kapott pTF 1 kifejező plazmid egy transzlációs stal-t kodont és a trp promotertöl lefelé egy humán IL-2 gépt tartalmaz. A pTF 1 plazmidot Stul restrikciós enzimmel hasítjuk és BamHI linkerrel kapcsoljuk. Ezt a plazipid DNS-t BamHI és EcoRI restrikciós enzimmel kezeljük és az EcoRI-BamHI helyen XPL promotert tartalmazó pTB 281-be építjük be. Az igy kapott kifejező plazmid a pTB 285 jelet kapja. (2) Escherichia coli N4830 törzset Cohen és munkatársai szerint (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 69, 2110, 1972) a fenti pTB 285 plazmiddal transzformáivá az adott plazmidot hordozó transzformánst kapunk (Escherichia coli N4830/pTB285). 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
