200792. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új fibrinolitikus enzimek és hatóanyagként a fenti enzimeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
13 HU 200792 D 1-1 Az egyik kísérletből származó géllemez denzitometriás mérésének eredményeit használjuk a molekulatömeg meghatározására. Az ismei't molekulatömegű standard proteinek elmozdulását. molekulatömegük logaritmusénak függvényében ábrázolva kalibrációs görbét kapunk, amelyen a GPK-ból származó enzim elmozdulását bejelölve kiszámíthatjuk annak molekulatömegét. Az eredmények alapján a GPK-ból származó tisztított protein molekulatömege 56000 ± 2000 nem redukáló körülmények között, és 62000 ± 3000 redukáló körülmények között (2-merkapto-etanol hozzáadásával), ami diszulfid-hidak jelenlétére utal. A molekulatömeg igen jól egyezik a Sephadex G-150 oszlopon gélszűréssel meghatározott 65000 ± 3000 közelítő molekulatömege. A BEB-böl származó enzimekkel is hasonló eredményeket kapunk. dl Izoelektromos fókuszálás Az izoelektromos fókuszálást LKB Ampholin poli(akril-amid) vékonyi'éteg géllemezen végezzük, 3,5 - 9,5 pH-tartományban, LKB Multiphor egységet használva. A gélre 20 pl alikvotot viszünk. A fókuszálást 8 W állandó áramerősséggel végezzük, 20 mA kezdeti áramerősség és legfeljebb 1,1 kV feszültség mellett. A fókuszálás hőmérséklete 10 °C, a futtatási idő 90 perc. A gél hosszéban kialakuló pll-gradienset 0,5 cm-enként, szobahőmérsékleten, kis méretű, 3 mm csúcsátmérójű kombinált felületelektróddal (Pye-Ingold, 403-30-M3 típus) és pll-méterrel (Corning model 7030) mérjük. A gélben lévő proteint Comassie brilliant blue R-250 (Sigma Chemical Co.) festékkel festjük, 10%-os triklór-ecetsavoldatos fixálás után. Az eredmények az 5. ábrán láthatók. Vizsgálataink szerint a GPK-ból és a BEB-ból származó tisztított enzim izoelektromos pontja (pl) 4,6. el Aminosav összetétel A GPK-ból és BEB-ből származó enzimek aminosavösszetételét Locarte aminosav-analizátorral határozzuk meg, miután a protein mintát 6 mól/l-es hidrogén-kloridban (Aristar) 110 °C-on 20 órán át tartó forralással hidrolizáltuk. Az enzimek aminosav-összetételét a 3. táblázatban adjuk meg. összehasonlításképpen a humán rosszindulatú melanoma sejtekből származó plazminogénaktivótor (HEPA) aminosav-összetételét [Rijken, D.C. és Collen, D.J. Bioi. Cheni. 256, 7035 (1981)] is megadjuk a 3. táblázatban. Az adatokból látható, hogy a GPK-ból és a BEB-ból származó enzimek összetétele alapvetően hasonló, csak a két különböző sejtvonal miatt elvárható különbségek észlelhetők. Viszont mind a GPK, mind a BEB aminosavösszetétele eltér az ismert HEPA összetételétől. f) Kinetikai vizsgálatok A GPK-ból származó enzim amidolitikus aktivitását különféle kromogén szubsztrátok segítségével határozzuk meg. Az aktivitást spektrofotometriásán mérjük, 1 cm úthosszú küvettában 37 °C-on Gilford system 2600 spektrofotométerrel, melyet egy Hewlett Packard 7225A kiíróhoz kapcsoltunk. A részben tisztított enzimeket különböző koncentrációjú kromogén szubsztrátokkal inkubáljuk 0,05. 3. Táblázat Aminosav-összetétel (maradékok %-os számában kifejezve) Aminosav Rosszindulatú Melanoma eredetű plazminogén aktivátor (HEPA)* GPK BEB Cisztein n.v.** 2,1 Asp 9,8 10,9 9,8 Thr 5,4 5,1 4,6 Ser 9,2 6,4 6,4 Glu 13,1 10,1 11,5 Pro 7,1 6,1 4,3 Gly 10,4 8,4 7,1 Alá 6,6 7,8 8,3 Val 4,1 6,0 6,7 Met 0,9 2,4 1,0 ILeu 3,0 4,8 3,5 Leu 8,1 9,7 13,9 Tyr 4,0 3,5 2,2 Phe 3,7 4,5 3,6 His 3,3 2,8 2,6 Lys 5,5 6,5 7,1 Arg 5,9 4,8 5,1 * Rijken, C.D. és Collen D. [J. Bioi. Chem. 256, 7035-7041 (1981)] adatai ** n.v.: nem vizsgált Mól/l-es Tris-HCl pufferben, a pH-t és az ionerősséget a 4. táblázatban adjuk meg. A GPK-ból származó enzim különböző szubsztrátokkal mutatott kinetikus paraméterei szintén a 4. táblázatban láthatók. A p-nitro-anilin kezdeti felszabadulását 405 nm hullámhosszon mérjük. A p-nitro-anilinre 10500 liter/mól.cm moláris extrinkcjós koefficienst használtunk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 9
