200786. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ciklosporinok előállítására
b) A szükséges elótenyészetet a 6. példa a) pontja szerint készítjük. A [Val]^-[(D)Ser]&-ciklosporint fermentorméretben is előállíthatjuk úgy, hogy a 6. példa c) pontjában leírtak szerint járunk el 5 a következő változtatásokkal: c) A termelő táptalajban a (DL)-norvalint 10 g (L)-valinnal helyettesítjük. A metanolnak a micéliumhoz való hozzáadása, homogenizálás és 10 szűrés után (ezt két ízben végezzük 90%-os metanollal) a kővetkezőképpen járunk el: A metanolos kivonatokat egyesítjük, és víz hozzáadása után vákuumban betűmé- 15 nyítjük. A visszamaradó vizes koncentrátumot etil-acetáttal háromszor extraháljuk, a kivonatokat kevés vízzel mossuk, egyesítjük, és vákuumban pároljuk. 20 A micélium és a szűrlet extrakciójából származó kivonatokat szűrjük, ’és ennek során eluálószerként a Sephadex LH-20 mennyiségére számítva 50-szeres mennyiségű me- 25 tanolt alkalmazunk. A csúcsfrakciókat kromatográfiás úton tisztítjuk: ennek során 40-szeres mennyiségű Silicagel 60 típusú szilikagélt (szemcsemérete 0,04-0,063 mm) és 30 eluálószerként vízzel telített etil— acetátot használunk. Az eluálás során elsőként a (Vall^ciklosporin távozik, ezt követi a ciklosporin és a [VallMíDjSerl^ciklosporin. E 35 későbbi frakciókat további kromatográfiás tisztításnak vetjük alá: ennek során százszoros mennyiségű Silicagel 60 típusú szilikagélt és eluálószerként aceton és hexán 1:1 40 arányú elegyét alkalmazzuk. A további tisztítást nagy nyomású kromatográfiával végezzük, ehhez megfordított fázisú szilikagélt (szemcsemérete 0,04-0,063 mm, Li- 45 Chropep RP 18 berendezés, a Merck cég gyártmánya) és eluálószerként metanol és víz 80:20 arányú elegyét alkalmazzuk. így tiszta [Val]2—C(DjSerJ^cikiosporinhoz ju- 50 tunk. 13 8. példa 55 Az 5. 6. példában leírt vegyület mikrobiológiai úton is előállítható a 6. példa a) pontjában leírtak szerint a következő változtatásokkal: a) a táptalajban a (DL)-norvalint 5 g 60 (L)-treoninnal helyettesítjük. Az inkubálás után a következőképpen végezzük az extrakciót: A micéliumot a tenyészfolyadéktól elválasztjuk, és Turrax-berendezésben 65 aprítás és keverés közben három ízben egyenként 9 liter 90%-os metanollal extraháljuk. Az aprított micéliumot az oldószertől vákuumszűréssel elválasztjuk, a szűrleteket egyesítjük, vizet adunk hozzá, és vákuumban 40 °C hőmérsékleten addig tőményitjük, amíg az eltávozó párlat főként vizet tartalmaz. Az így kapott keveréket három ízben egyenként 5 liter etil-acetáttal extraháljuk. A szerves fázisokat egyesítjük, és vákuumban 40 hőmérsékleten betőményitjük. Az így kapott maradékot 2 kg Sephadex. LH-20 gélen (a Pharmacia cég gyártmánya) metanollal gélszűrésnek vetjük alá. A ciklosporin-keveréket tartalmazó frakciókat egyesítjük, és 2 kg szilikagélből (szemcsemérete 0,02-0,045 mm, .Grace*) készült oszlopon, eluálószerként vízzel telített etil-acetát alkalmazásával kromatografáljuk. A polaritással összhangban az eluálás során elsőként távozik a ciklosporin, ezt követi a [(DjSerl^ciklosporin, majd a [ThrJ^ciklosporin és végül a nyers [ThrlMíDjSer]8- -ciklosporin. A legutóbbi komponens további tisztítását 50 g szilikagélből (szemcsemérete 0,02- -0,45 mm, .Grace") készült oszlopon, eluálószerként aceton és hexán 2:1 arányú elegyének alkalmazásával végezzük. így amorf, fehér por alakjában tiszta [Thr]2—f (D) -Ser]®-ciklosporinhoz jutunk. b) A szükséges elótenyészetet a 6. példa b) pontjában leírt eljárással készítjük. A [ThrlMCDlSerl^ciklosporint fermentorméretben is előállíthatjuk, ha a 6. példa c) pontjában leírt eljárást követjük a következő változtatásokkal: c) A termelő táptalajban a (DL)-norvalint 5 g (L)-trenoinnal helyettesítjük. Az inkubálás és a micéliumnak Westfalia-típusú szeparátorral való elkülönítése után a következőképpen járunk el: A micéliumot metanollal keverjük, homogenizáljuk és szűrjük. Ezt az extrakciót 90%-os metanollal két ízben megismételjük. A metanolos kivonatokat egyesítjük, vizet adunk hozzá, és vákuumban betóményitjük. A visszamaradó vizes koncentrátumot etil-acetáttal két ízben extraháljuk, a kivonatokat kevés vízzel mossuk, egyesítjük, és vákuumban betőményitjük. A micélium kivonatait szűrjük, s ekkor eluálószerként a Sephadex LH-20 mennyiségére számítva 50-14 HU 200786 B 9
