200785. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gonadotropin releasing hormon antagonistái előállítására
9 HU 200785 B 10 tidnek a gyantáról való lehasitását és az oldalléncokban szereplő védócsoportok teljes lehasitását igen könnyen elvégezhetjük 0 °C hőmérsékleten, hidrogén-fluoriddal. A hidrogén-fluoriddal való kezelés előtt a gyantához kötött, védett pepiidhez savmegkötő szerként anizolt adunk. A peptid lehasitása és a védőcsoportok eltávolítása után a hidrogén-fluoridot csökkentett nyomáson ledesztilláljuk, a gyantát 50%-os ecetsavval kivonatoljuk, és a kivonatot fagyasztva szárítjuk, ily módon porszerü anyag formájában kapjuk a nyers peptidet. A lehasítási reakció kitermelése lényegében kvantitatív. A peptidet úgy tisztítjuk, hogy karboxi-metil-cellulózon (Whatman CM 32), gradiens elúcióval (0,05 molos-tól 0,03 molos-ig növekvő koncentrációjú ammónium-acetát-oldattal, metanol és víz 1:1 arányú elegyében), ioncserélő kromatográfiát végzünk, majd pedig egy gélszűrővel töltött oszlopon n-butanol és 0,1 normál ecetsav-oldat 1:1 térfogatarányú elegyével eluálva megoszlásos kromatográfiát végzünk. Az így előállított peptid a (különböző futtatóelegyekkel végzett) vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálat, valamint a fordított fázisú nagynyomású folyadék-kromatogréfiés vizsgálat (eluens: vizes trietil-ammónium-foszfát-oldat és acetonitril elegye) szerint egységes. A fentiek szerint előállított, tisztított peptid aminosav-analízise összhangban van a kívánt szerkezettel, és a peptidláncban szereplő valamennyi aminosavra lényegében egész számú értékeket ad. A termék optikai forgatóképessége egy fotoelektromos polariméteren mérve: [oC]d2J=-2,2d±1° (c=1,50%-os ecetsav). A fentiekben leírt peptideket in vivo körülmények között (az élő szervezetben) vizsgáljuk, és meghatározzuk, milyen mértékben képesek meggátolni nőstény patkányokban az ovulációt. E vizsgálathoz előre meghatározott számú (tíz) felnőtt nőstény, Sprague-Dawley törzsbeli, 225-250 g testsúlyú patkányokat használunk. Az állatoknak a proösztrusz napján körülbelül déli 12 órakor injekció formájában beadunk 10 pg, kukoricaolajban oldott peptidet. A proösztrusz az ösztrusz (ovuláció) napját megelőző nap. Kontrollként nőstény patkányok egy külön csoportját használjuk, ezeknek az állatoknak nem adunk be peptideket. Az ösztrusz napján valamennyi, kontrollként használt nőstény patkány ovulál; a kezelt állatok közül egyikben sem történik meg az ovuláció. Ezért úgy tekintjük, hogy a vizsgált peptid igen alacsony dózisban jelentős mértékben gátolja a nőstény patkányok ovulációját, és körülbelül 10 pg-os dózisban teljesen hatékonynak ítéljük. További vizsgálatokat végezhetünk a fentinél alacsonyabb vagy magas dózisokkal, az eredményeket a II. táblázatban adjuk meg. II. Táblázat Példa száma Dózis (pg) In vivo Ovulációk száma í. 2.5 0/8 1 9/10 2. 2.5 0/8 1 9/10 3. 2.5 5/10 i 6/6 4. 7.5 0/10 2.5 6/10 5. 7.5 6/10 6. 25* 0/6 5* 7/7 7. 7.5 4/10 2.5 9/10 *= Az injekció elkészítéséhez oldószerként fiziológiás nátrium-klorid-oldatot használunk. A vizsgálatok alapján úgy tekintjük, hogy valamennyi peptid igen alacsony dózisban hatékonyan gátolja a nőstény emlősök ovuíációját. E peptideket gyógyászatilag elfogadható, nem-toxikus sóik formájában, például savaddiciós sóik vagy fém-komplexeik, mint például cinkkel, báriummal, kalciummal, magnéziummal, alumíniummal vagy más, hasonlókkal készült komplexeik formájában (amely komplexeket a jelen leírásban addíciós sóknak tekintjük), vagy e két típus kombinációja formájában adagolhatjuk. Ilyen savaddíciós sók például a hidrokloridok, hidrobroraidok, szulfátok, foszfátok, nitrátok, oxalátok, fumarátok, glükonétok, tannátok, maleátok, acetátok, citrátok, benzoátok, szukcinátok, alginátok, almasavas sók, aszkorbátok, tartarátok és más, hasonlók. Ha a hatóanyagot tabletta formájában adjuk be, akkor a tabletta tartalmazhat valamely gyógyászatilag elfogadható hígítószert, például kötőanyagot, mint például tragakantát, kukoricakeményitót vagy zselatint; egy szétesést elősegítő anyagot, mint például alginsavat; és egy csúsztatószert, mint például magnézium-sztearátot. Ha a hatóanyagot cseppfolyós halmazállapotú készítmény formájában kívánjuk adagolni, akkor a gyógyászatilag elfogadható higitószer tartalmazhat édesítő- és/vagy ízesítőanyagokat, továbbá intravénás adagolás esetében a vérrel azonos ozmózisnyomású nátrium-klorid-oldatban jelen lehetnek foszfát-puffer-oldatok és más, hasonlók. A gyógyászati készítmények a peptidet általában valamely szokásos, önmagában ismert, gyógyászatilag elfogadható vivóanyaggal együtt tartalmazzák. Intravénás adagolás esetében a dózis általában a kezelni kívánt egyed egy testsúlykilogrammjára számítva körülbelül 1 pg és körülbelül 100 pg között 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
