200783. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immunstimulens hatású peptid-szubsztituált heterociklusos vegyületek és az azokat tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
7 HU 200783 B 8 karbodiimid-reagensek előnyben részesülnek, mivel lehetővé teszik a környezeti hőmérséklet alkalmazását és biztosítják a kívánt észterek kielégítő hozamát. A (13) képletű végtermékeket könnyen előállítjuk (11) vagy (12) képletű vegyietekből oly módon, hogy ezeket a vegyieteket a megfelelő HfNlI^MCHzJxly-R általános képletnek megfelelő aminnal reagáltatjuk, amelyben R, R1, x és y jelentése az előzőekben megadottakkal egyezik. A (11) képletű vegyületekkel való reakciót valamely kapcsoló szer, igy 'az előzőekben felsorolt ilyen szerek egyikének a .jelenlétében és egy a reakcióval szemben közömbös oldószerben 0 °C-tól 30 °C-ig terjedő hőmérséklettartományban vitelezzük ki. Az 1-hidroxi-benzotiazolt, amelyet a reakcióelegyhez adagolunk általában mólegyenértéknyi mennyiségben használjuk az amin-reagenshez viszonyítva, és arra szolgál, hogy növelje a kivánt kondenzációs termék hozamét. A (12) képletű aktivált észtereknek az átalakítását (13) képletű végtermékekké úgy végezzük, hogy az említett aktivált észtert megfelelő H[N(R1)(CH2)x]x-R általános képletű aminvegyülettel reagáltatjuk, amelynek a helyettesitői a fent megadottakkal egyeznek, valamely a reakcióval szemben közömbös oldószerben 0 °C-tól 30 °C-ig terjedő hőmérséklettartományban 1-hidroxi-benzotriazol jelenlétében, amelynek a mennyisége 0,1- -0,2 mól egy mól amin-reagensre számítva. Az így kapott (13) képletű védett vegyieteket ezután hidrogénezzük szénre felvitt palládium-katalizátor felett annak érdekében, hogy eltávolítsuk az amino- és karboxicsoportokat védő csoportokat. A reakciót vizes ecetsavban ismert módszerekkel végezzük. A védőcsoportok lehasitásét végezhetjük azonban trifluor-metán-szulfonsavval is. Az (I) általános képletű vegyületek gyógyszerészetileg elfogadható sóit úgy állítjuk elő, hogy e vegyületek valamely oldatát, előnyösen vizes oldatát bázissal vagy savval, mégpedig az előzőekben felsorolt bázisok vagy savak valamelyikével kezeljük általában sztöchiometrikus arányokban. A sókat bepárlás vagy kicsapás útján különítjük el. Ezek azonban nem tartoznak az oltalmi körbe. A találmány szerinti eljárással előállított termékeket különböző kórokozó mikroorganizmusok, különösen gram-negatív baktériumok által okozott betegségekben szenvedő humánbetegek és emlősök terápiás kezelésére használjuk fel gyógyszerkészítmények alakjában. Ezek a vegyületek immostimulásokként is használhatók humánbetegeknél és emlősöknél, ha meglévő vagy klinikailag előidézett immungátlás esete áll fenn. A vizsgálati módszert, amelynél C3H/HeM hím egereket alkalmazunk a Charles River Breeding Laboratory-ból, az alábbiakban mutatjuk be. Az egereket a kezelés előtt 5 napig akklimatizáltuk és szubkután (SC) vagy orálisan (PO) kezeltük azokat 0,2 ml különböző hígítású vizsgálandó anyaggal (10, 1 és 0,1 mg/kg) vagy placebo-val (pirogénmentes sóoldat). A kezelés módját az alkalmazott fertőző organizmusnak megfelelően választottuk meg: -24 és 0 órával a fertőzés előtt Klebsiella pneumoniae esetén, és -6, -5, -4 és -1 nappal az Escherichia colival vagy Pseudomonas aeruginosa-val való fertőzésnél. A fertőző anyagot intramuszkulárisan (IM) adtuk be a csípőbe K. pneumoniae vagy intraperitoneálisan (IP) E. coli és P. aerigunosa esetében. A fertőzéshez 0,2 ml mennyiséget használtunk. A pusztulást 7 nap elteltével állapítottuk meg K. pneumoniae fertőzésnél és 3 nap után a másik két mikroorganizmussal végzett fertőzés esetén. Tenyészetkészítés: K. pneumoniae: A tenyészetet felkentük tisztítás érdekében fagyott vér-alapanyagból származó agy-szív-infúziós agarlemez felületére (BHI=brain heart-infusion). Három kolóniát vettünk ki a 18 órás lemeztenyészetből és azokat' 9 ml BHI táptalajra tettük. A táptalajtenyészetet 2 óra hosszat tartottuk 37 °C-on forgó rázógépen és utána 0,2 ml mennyiségeket kentünk különböző BHI agar ferdetenyészetekre, amelyeket 18 óra hosszat inkubáltunk 37 °C-on. A ferdetenyészeteket BHI táptalajjal mostuk, majd a tenyészet sűrűségét egy spectronic 20 segítségével beállítottuk és megfelelő hígítást végeztünk azért, hogy LD100-as fertőzésszintet érjünk el egerekben (körülbelül 250 CFU állatonként). (CFU=Colony forming units=kolóniaképző egység). E. coli vagy P. aeruginosa: A tenyészetet felkentük tisztítás végett fagyott vér-alapanyagból származó BHI agarlemez felületére. Éjszakán át történt inkubálás után különböző kolóniákat tettünk 100 ml Difco tápagarra 250 ml-es Erlenmeyer lombikban, majd 18 óra hosszat inkubáltuk azokat 30 °C-on egy New Brunswick forgó rázógépen és utána 1:10 arányú hígítást végeztünk 90 ml friss táptalajjal. A tenyészetet 30 °C-on inkubáltuk (forgó rázógépen 200 ford/perc sebesség mellett) 3 óra hosszat és a sűrűséget 78%-osra állítottuk be spectronic 20 segítségével, végül BHI táptalajjal hígítottuk LD90 elérése végett és interperitoneálisan befecskendeztük egerekbe. Abban az esetben, ha a találmány szerinti eljárással előállítható vegyületeket fertőzésgátló vagy immunstimuláló szerek hatóanyagaiként használjuk, akkor kényelmesen beadhatjuk azokat orálisan, szubkután, intramuszkulárisan, intravénásán vagy intraperitoneálisan készítmények alakjában. Ilyen készítmények a hatóanyag mellett valamely gyógyszerészeti vivőanyagot tartalmaznak, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
