200704. lajstromszámú szabadalom • Összefüggő pórusokkal rendelkező membrán-szerkezetek
HU 200704 B 7 Protein Molekula tömeg IEP A rajzokban 1. Mioglobin 17.000 6,6 M 2. Szubtilizin 27.000 9,4 S 3. Ovalbumin 43.000 4,6 o 4. Szarvasmarha szérum albumin 67.000 4,7 BSA 5. Ferritin 440.000 43 F A 6. ábra az ezen anyagok visszatartási aránya alapján meghatározott teszt értékek interpolációjával megszerkesztett visszatartási görbét mutatja. A visszatartási görbén éles határ mutatkozik a szubtilizin és az ovalbumin molekulatömege közötti értéknek megfelelő visszatartási arányban. A visszatartási görbe azt is igazolja, hogy a P-membránok azonos méretű összefüggő pórusokkal rendelkeznek. A visszatartási görbe formája alapján feltételezhető, hogy a pórusok átmérője 4-5 nm. Az ezzel az ultraszűrő membránnal meghatározott átfolyási arány 2.10s Pa membrán-túlnyomás esetén mintegy 480 1/óra.m2. Az átfolyási arány azonban a lerakódott P-membránok mennyiségétől függ. így, ha lerakódott P-membránok mennyisége 50 jjLg/cm , ez az érték 2201/óra.m2 értékre csökken. A fenti módon előállított ultraszfirő membrán további előnyös tulajdonságokkal rendelkezik, amelyeket a következőkben ismertetünk. A szabad amino- és karboxilcsoportok különbözőképpen járulnak hozzá az S-réteg-fragmensek, illetve a nemtérhálósodott P-membránok eredő elektromos töltéséhez, az őket körülvevő vizes közeg pH-jától függően. 9,0 pH-érték eléréséig az aminocsoportok pozitív töltést eredményeznek, míg a karboxilcsoportok negatív töltést eredményeznek 2,0 pH-értékig. Egy bizonyos pH-értéknél, azaz az izoelektromos pontjuknál (IEP) a negatív és pozitív töltések kompenzálják egymást, így az S-réteg-fragmensek és P-membránok kifelé elektromosan semlegesnek mutatkoznak. A jelen példában a P-membrán potenciálisan pozitív töltéssel rendelkező csoportjai elvesznek azáltal, hogy a P- membránok proteint tartalmazó molekuláiban található lizm molekulák e-aminocsoportjait glutáraldehiddel térhálósítjuk, ezáltal a térhálósított P- membrán EIP értéke a savas tartományba kerül, mégpedig kisebb érték lesz, mint pH=2,0. A térhálósított P-membránok negatív eredő töltése sok esetben hatásos védelmet jelent a membrán pórusok eltömődése ellen fiziológiás körülmények között végzett szűrések esetén. A 7. ábrán sematikusan bemutatjuk a jelen példa szerint előállított ultraszűrő membrán egy részletét. A18 mikroszűrő 19 összefüggő pórusai felületére lerakódtak a 20 P-membránok, és ott keresztkötéssel vannak rögzítve. Ezeket tehát olyan mennyiségben alkalmazzuk, hogy a P-membránok teljes felületének mennyisége mintegy két-háromszorosa legyen az ultraszűrő membrán felületének, így a P-membránok általában két rétegben helyezkedjenek el, és azok fedjék át egymást. 2. példa Az 1. példától eltérően Bacillus stearothermophilus pV 72 sejteket alkalmazunk. Ezeknek a sejtburka szintén dtoplazma membránból, peptidoglikánt tartalmazó rétegből és proteint tartalmazó molekulákból álló S-rétegből épül fel. A P-membrán-szuszpenziót az 1. példában leírt módon a sejtburokból állítjuk elő. Ennek abacillusnak a sejtburkából nyert S-réteg, illetve P-membránok hexagonális (pó-szimmetriájú) rácsszerkezetet mutatnak 18 nm periodicitással. Ultraszűrő membránként alkalmazható szerkezet előállításához a 2 nyomás alatt működő berendezésben egy tárcsa formájú, 150 pjn vastagságú Ultipor D66 T típusú (Pall, Cortland, USA gyártmány) tárcsa formájú nylon mikroszűrőt helyezünk el hordozóként. Ez a nukroszfirő 1:1 arányban tartalmaz szabad amino- és karboxilcsoportokat. Az 1. példa szerintihez hasonló módon eljárva a P- membrán-szuszpenziót olyan mennyiségben yiszszük fel a mikroszűrőre, hogy a mikroszűrő cm-jeire számítva 30 itg P-membrán legyen a szuszpenzióban. A P-membránok lerakódnak a mikroszűrőre, illetve belerakódnak a mikroszűrő szivacsos szerkezetébe, amikor 2.10s Pa túlnyomást alkalmazunk. A 8. ábrán bemutatjuk a 21 mikroszűrő részletét, amely szabálytalan szivacsszerű szerkezettel rendelkezik, egy átlagérték körül véletlenszerűen elosztó pórusméretekkel. A lerakódott 20 P-membránokat szintén ábrázoltuk. A 20 P-membránokon és 21 mikroszűrőn 2.10s Pa túlnyomással 1 ml 0,1%-os dimetil-szuberimidát-oldatot (1 mól/l-es trietanol-amin-pufferben, pH=9,5) sajtolunk át 4 #C-on, 60 perc alatt. A dimetil-szuberimidát, lévén egybifunkcionális imidoészter, egy aldehidhez hasonló módon intra- és intermolekulárisan reagál elsősorban a P-membránokban található proteint tartalmazó molekulák lizinjének e-aminocsoportjaival, valamint a nylon mikroszűrő anyagának aminocsoportjaival. Néhányszofísmételt mosás után az ultraszűrő membrán alkalmazásra kész. A 9. ábra az ultraszűrő membrán visszatartási görbéjét mutatja. Az 1. példában ismertetett membránhoz hasonlóan itt is éles határ mutatkozik az elválasztható molekulatömegekben. A dimetil-szuberimidát és az e-aminocsoportokreakciójával kialakított amidinek pozitív töltést képviselnek a lizin e-aminocsoportjaihoz hasonló módon, így a P-membránok eredő töltése alig változik a térhálósítással. Az 1. és 2. példában ismertetett, P-membránokból kialakított szerkezetek, amelyek előnyösen ultraszűrő membránokként alkalmazhatók, az idegen molekulákkal kialakított keresztkötések jelenléte következtében kiváló kémiai, termikus és mechanikai stabilitást mutatnak. Különösen proteolitikus degradációval szemben stabilak, így autoklávban kezelhetők, és savas vagy lúgos közegben (1 és 13 pH-érték között), valamint nagy koncentrációjú kaotropikus szerekkel (pl. 5 mól/l-es guanidin-hidroklorid, 8 mól/l-es karbamid) együtt is alkalmazhatók. A P-membránokból kialakított szerkezetek további fontos tulajdonsága, hogy szerves folyadékoknak, így ketonoknak, alkoholoknak és klórozott 8 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
