200698. lajstromszámú szabadalom • Eljárás micellás részecskék stabilizálására
HU 200698 B A találmány micellás részecskék stabilizálására és ezeket tartalmazó szuszpenzió tárolási idejének növelésére alkalmas eljárásra vonatkozik. Az eljárás során micellás részecskéket szuszpendáltmk valamely polimer gél-oldatban (gél-beágyazóanyagban), majd a szuszpenziót szobahőmérséklet alatti hőmérsékletre lehűtve megszilárdítjuk és kívánt esetben a hőmérséklet növelésével folyékony szuszpenzióvá visszaalakítjuk. Micellás részecskéknek, így például foszfolipidrészecskéknek vagy liposomáknak (ahogy ezeket szokásosan nevezik) gyógyszerek és diagnosztikai készítmények vivőanyagaiként való felhasználása kiterjedt kutatások tárgya: Ryman B.E., et al., Ann. N.Y. Acad. Sei., 308, (1978); Gregoriadis, G., Ed., „Liposome Technology, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, Vol. II (1984); Fendler J.H., Acc. Cbem. Rés., 13, 7 (1980); és Weinstein J.N., et al., Science, 204, 188 (1979). Foszfolipid-miceÚás részecskék hatásosan alkalmazhatók például enzimek, gyógyszerek (különösen anti-tumor gyógyszerek), kelátképző anyagok, hormonok, radionuclidek, sejtmódosító anyagok, antigének, antitestek, interferon-gerjesztők és vírus subunitrészecskék vivőanyagaiként. Azonban a liposomák (különösen azok, amelyeket kisfrekvenciás ultrahanggal hoztak létre) termodinamikailag nem stabilisak a fázisátalakulás hőmérsékletén és hajlamosak arra, hogy össdzetömörüljenek vegy egyesüljenek és nagyobb unilamellás részecskéket alkossanak hosszú ideig történő tárolás során: Sheetz M. P., et al., Biochemistry, 11,4573 (1972); Lawaczeck R.L., et al., Biochem. Biophys. Acta, 443. 313 (1976); Larrabee HJL, Biochemistry, IS, 3321 (1978); és Shullery S.E., et aL, Biochemistry, 12,3919 (1980). Kis részecskéknek nagyobb részecskékké történő összetömörülése vagy egyesülése megvbáltoztatja az eredeti tulajdonságaikat és ez módosíthatja az áteresztőképességet valamint az in vivo bioeloszlást: Kao Y. J., et al., Biochem. Biophys. Acta., 677.453 (1981); és Ábra R. M., et al., Biochem. Biophys. Acta., 666, 493 (1981). Igen fontos tehát, hogy a micellás részecskék tárolhatók legyenek anélkül, hogy a részecskék összetömörülnének vagy egyesülnének, mivel az összetömörülés eredményeként számos tulajdonságuk megváltozhat. A találmány szerinti eljárással meggátolhatjuk a micellás részecskék előbb említett összetömörülését vagy egyesülését olymódon, hogy a micellás részecskéket vizes polimer gél-oldatban, mint beágyazóanyagban tároljuk. A beágyazóanyag olyan természetes vagy szintetikus matrix lehet, amely szobahőmérsékletnél alacsonyabb hőmérsékleten szilárd gél és képes folyékonnyá alakulni szobahőmérsékleten vagy magasabb hőmérsékleten történő olvasztás esetén. Ilyen alkalmas anyagok például a poliszacharidok és a polipeptidek. Alacsonyabb hőmérsékleten való tárolásnál a gél megszilárdul és ez korlátozza a részecskék mozgását. Ez lelassítja a mozgást és így megelőzhető a részecskék összetömörülése vagy egyesülése. íly módon a micellás részecskék mérete és tulajdonságai megmaradnak a tárolás során mindaddig, ameddig a gél szilárd állapotban marad. Szobahőmérsékleten vagy magasabb hőmérsékleten azon-1 ban a gél megolvad és a részecskék visszalakulnak eredeti alakúkba, így szuszpenzióvá vizes köztegben. Ez felhasználható befecskendezésre vagy más alkalmazásra ugyanúgy, mint a frissen készített szuszpenzió, mivel nem történt lényeges változás a részecskék tulajdonságaiban vagy in vivo bioeloszlásában. A találmány szerinti eljárást például a következő foszfolipidek esetében alkalmazhatjuk: díszteoaril-foszfatidil-kolin (DSPC), dipalmitoil-foszfatidil-kolin (DPPC) és a dimirisztoil-foszfatidil-kolin (DMPC), valamint a természetes foszfolipidek, így a tojás-lecitin és a szójabab-ledtin. A részecskék gyógyászati készítményeket, így antibiotikumokat is foglalhatnak magukban, ahogy a későbbi példákból láthatjuk, továbbá a tárolás után megjelölhetjük őket valamely radioaktív elemmel, így lllin-nel. Az itt használt „micellás részecskék és „micellák megjelölések olyan részecskékre vonatkoznak, amelyek amphiphillicus molekula-aggregációból származnak. Előnyös amphiphilek a biológiai lipidek. A „micellás részecske megjelölés általában szférikus micellákra vonatkozik, amelyeket gyakran olyan lipidből kapunk, amely kétrétegű membránt alkot és „liposoma-nak nevezünk. Ezek készítésére alkalmas módszerek jól ismertek a szakterületen, így például valamely foszfolipidből, például disztearoil-foszfatidil-kolinból vagy ledtinből készíthetjük és ezek magukban foglalhatnak más anyagokat is, így semleges lipideket és felületmódosító anygokat, például pozitív vagy negatív töltésű vegyületeket, antigéneket, antitesteket, szacharidokat és lecitineket. Az előállítás módjától függően a részecske egyszerű kétrétegű szférikus kagyló (unilamelláris) lehet, de többréteggel is rendelkezhet (multilamelláris). A leírásban előforduló rövidítések jelentéseit a következőkben összefoglalva feltüntetjük: DSPC — disztearooil-foszfatidil-kolin Chol= koleszterin DPPC = dipalmitoil-foszfatidil-kolin DMPC= dimirisztoil-foszfatidil-kolin DTPA= dietilén-triamin-pentaecetsav EDTA = etiléndiamin-tetraecetsav SUV = kis unilamelláris részecskék Micellák készítéséhez használt anyagok és a készítési mód L-a-disztearoil-foszfatidil-kolint (DSPC) és koleszterint (Chol) használtunk további tisztítás nélkül. Koleszterinoleátot [01eate-l-14C] (fajlagos aktivitás 51 ci/mól) és 14C-etiléndiamin-tetraecetsavat [Acetic 2-14C] (EDTA; fajlagos aktivitás 4,38 mCi/mmól) alkalmaztunk. Ugyancsak tisztítás nélkül használtunk nitrilo-triecetsav-nátriumsót (NTA) és EDTA-t, valamint Radiochemical nInCl3-at (kutatási tisztaság). Beszereztünk továbbá Ionophone A23187-et, Agarose-t (Type IX) és zselatint (Knox-zselatin) a kereskedelemből. Az Agrose a poliszacharid komplex (Agár) semleges gélfrakciója, amelyet a Rhodephycae-család agarocitáiból extraháltunk, míg a zselatin kollagénből származó vízoldható, nagy molekulasúlyú proteinek heterogén elegye. BDF1 egereket a Somonson laboratóriumból szereztünk be (Gilroy, VA). A to2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
