200658. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyapotmag-ormányos, burgonyabogár, lucernaormányos, bacillus thuringiensis toxin alkalmazásával és kukorica gyökérféreg irtására
1 HU 200658 B 2 rovarok ellen, vagy pedig csalogatóanyagot, valamint B.t.sd. spórákat és kristályokat tartalmazó csalétek-szemcséket juttathatunk a talajra. A B.t.sd. készítményeket a magvak beburkolására, gyökérkezelésre vagy a termőciklus későbbi szakaszaiban teljes növény kezelésére is felhasználhatjuk. Az alábbiakban a találmány szerinti eljárás kivitelezését példákkal szemléltetjük, ideértve a legjobb módszert is. E példák azonban nem értelmezhetők a találmány oltalmi körét korlátozó jellegűeknek. A leírás során a %-ban megadott összes érték tömeg%-ot jelent, az oldatok keverékaránya térfogatra vonatkozik, ha csak azt másképp nem jelezzük. 1. példa A B. thuringiensis san diego NRRL B-15939 törzs tenyésztése A B. thuringiensis san diego NRRL B-15939 törzs egy tenyészetével oltjuk az alábbi összetételű, LB jellel jelölt táptalajt: Tripton 10 g élesztőkivonat 5 g nátrium-klorid 5 g 5 normál nátrium-hidroxid 0,6 ml víz 1000 ml. Az ismert mikrobiológiai módszereknek megfelelően, a fenti táptalajt oltás előtt sterilezzük, és az oltást steril körülmények között végezzük. Egy jó eredményeket adó módszert vázolunk az alábbiakban. Egy sorozat PWYE táptalajt készítünk. Ennek összetétele a következő: pepton 5,0 tömeg% élesztőkivonat 0,1 tömeg% nátrium-klorid 0,5 tömeg% Az 1 1 vízzel készült oldat pH-ját 7,5-re állítjuk be, majd 150 ml-es Erlenmeyer-lombikokban sterilezzük, és beoltjuk a B. thuringiensis M-7 NRRL B-15939 törzs petri csészén nőtt tenyészetével. A lombikokat 30 °C hőmérsékleten, kör mentén mozgó rázógépen (200 fordulat/perc) egy éjszakán át inkubáljuk. Ezzel az inokulummal oltunk 300 ml 2 1 térfogatú lombikokban levő LB táptalajt. Az oltáshoz 7,5 ml inokulumot használunk. Az LB táptalajt tartalmazó lombikokat az előtenyészettel azonos körülmények között inkubáljuk, és a tenyészeteket négy nap múlva összegyűjtjük. A fenti módszert a szakirodalomból jól ismert módszerek felhasználásával nagy térfogatú fermentorokra is kiterjeszthetjük. A fermentáció során nyert Bt spórákat és kristályokat az irodalomból jól ismert módszerek segítségével különítjük el. Gyakran használt módszer az összegyűjtött fennentlé elválasztási technikákkal, például centrifugálással történő feldolgozása. 2 2. példa A B. thuringiensis san diego NRRL B-15939 törzs spóráinak és kristályainak vizsgálata A B. thuringiensis san diego NRRL-15939 törzs előzőekben megadott módon nyert spóráit és kristályait a következő eljárásokat alkalmazva, különböző rovarokkal szemben vizsgáljuk. A Diabrotica undecimpunctata-val, a Leptinotarsa decemlineata-val és a Pyrrhalta luteola-val szembeni vizsgálatok során a spóra- vagy kristálypreparátumokat, illetve a tisztított kristályokat permet alakjában a megfelelő gazdanövényből származó levélkorongokra juttatjuk. Az Aedes aegypti-vel szembeni vizsgálat során a spóra- vagy kristálypreparátumot vízben adjuk a lárváknak. Valamennyi egyéb vizsgálat során a spóra- vagy kristálypreparátumot, vagy a tisztított kristályokat egy megfelelő standard táplálékkal vegyítjük. Részletesebben szólva, a burgonyabogánál és a gyapotmag-ormányossal szembeni vizsgálatot a következőképpen végezzük: A) A különböző koncentráicójú B.t.sd. spóra- vagy kristálypreparátumokat készítünk az 1. példa szerint eljárva, majd burgonyleveleket merítünk ezek vizes oldatába, a leveleket 1 órán át levegőn szárítjuk, majd második lárvaállapotú kolorádói burgonyabogár-lárváknak adjuk. Minden dózist 20 lárvával szemben vizsgálunk, és a vizsgálatot még egyszer megismételjük. A mortalitást 48 óra után határozzuk meg. Az LC-50 értéket probit analízissel határozzuk meg. E módszer 7,6 x 106 spóra/oldat ml LC-50 értéket eredményez. Az LC-50 érték azt a letális koncentrációt jelöli, amely a lárvák 50 %-ának pusztulását okozza. B) Különböző koncentrációjú B.t.sd. spóra- vagy kristálypreparátumokat készítünk, az 1. példában leírtak szerint kapott termék vizes oldásával és ezeket a gyapotmag-ormányos standard tápjába keverjük. Második lárvaállapotú gyapotmag-ormányos-lárváknak adjuk a tápkeveréket, és a mortalitást 48 óra elteltével becsüljük fel. A B.t.sd. minden dózisát 20 lárvával szemben vizsgáljuk, és a vizsgálatot még egyszer ismételjük. Az LC-50 értéket propit analízissel határozzuk meg (Finney, Probit Analysis, 3. kiadás, Cambridge University Press, Cambridge, 1971). Ez a módszer 4,65 x 105 spóra/tápkeverék ml LC-50 értéket eredményez. 3. példa A B.t.sd. lucernaormányos-ellenes hatása Különböző koncentrációjú B.t.sd. spóra- illetve kristálypreparátumokat állítunk elő, az 1. példában megadottak szerint. Lucemahajtás-darabokat mártunk ezek vizes oldatába, majd 15 percen át levegőn szárítjuk. A hajtásdarabokat ezután egy kis fiolányi vízbe állítjuk, lucemaormányos lárvákat helyezünk a levelekre, majd az így összeállított kísérleti rendszert zárt tenyésztőkamrába helyezzük. Minden hatóanyag-dózist 20, második lárvaállapotú lárvával szemben vizsgálunk, és a kísérletet háromszor ismételjük. A legnagyobb vizsgált dózist 7,6 x 107 spóra/oldat ml, 96 óra elteltével 80 %-os mortalitást eredményez. A túlélő lucernaormányos-lárvák fejletlenek, és nem táplálkoznak. Az alacsonyabb koncentrációk csak minimális mértékű pusztulást eredményeznek, ám jelentős mértékű táplálkozás-gátlást okoznak. Valószínű, hogy ezek a táplálkozásukban gátolt lárvák a mezőn - természetes környezetükben - még a kifejlett rovar-állapotuk elérése előtt elpusztulnának. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
