200615. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az emberi szövetekben található plazminogén aktivátor és ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 200615 B 2 minsav - tirozin - cisztein - aszparaginsav (W-E-Y-C-D) aminosav-szekvenciát kódolják. 7. A pozitív cDNS klónokból elkülönítettük a plazmid DNS-t, és meghatároztuk a szekvenciáit. 8. Az ismert szekvenciájú, t-PA-kódoló DNS-t ezután in vitro átalakítottuk és beillesztettük megfelelő kifejező hordozóba, amelyet felhasználtunk egy alkalmas gazdasejt transzformálására. Ez utóbbi tenyésztésével termeltük a kívánt emberi szövetekben található plazminogén aktivátort. 9. Az ily módon előállított, az emberi szövetekben található plazminogén aktivátor mintegy 251 aminosavat tartalmaz az enzimes szerin proteáz részében, s ezt követően egy „kringle” - tartalmú szekvencia található, amely jelenlegi ismereteink szerint a fibrin megkötéséért felelős. Az érett fehérje és a jel előszekvenciája összesen 562 aminosavat tesz ki. A fentebb ismertetett eljárással eredményesen állítjuk elő a tiszta t-PA-t. Ha a találmány szerinti eljárásnál egy további, a metotrexátra érzékeny kódoló szekvenciát alkalmazunk, akkor naponta és sejtenként több mint 0,1 pg mennyiségben állíthatjuk elő a gazdasejtek tenyészetében az antigén szempontjából aktív t-PA fehérjét. A termelést növelő feltételek megfelelő alkalmazásával több mint 20 pg terméket állíthatunk elő naponta és sejtenként. Másképpen kifejezve, a géntermelés mértéke meghaladja a 9 x 10-6 viszonyított egységet, naponta és sejtenként, vagy alkalmas termelésnövelés esetén a 18 x 10-4 viszonyított egységet, naponta és sejtenként a t-PA aktivitására vonatkoztatva. A találmány szerinti eljárásnál felhasználjuk a metotrexátot, amely bár általában végzetes a felvételére képes sejtekre; ha szabályozott mennyiségben van jelen akkor lehetővé teszi a sejtek növekedését a DHFR kódoló szekvenciát kódoló gén felerősítésével [Schimke és munkatársai, Science, 202, 1051 (1978); Biedler és munkatársai, Cancer Res., 32, 153 (1972); Chang és munkatársai, Cell, 7, 391 (1976)]. Ilyen szempontból fontos annak bemutatása, hogy a DHFR-re vonatkozó gén felerősítése a vele kapcsolatos, más fehérjéket kódoló szekvenciákat is felerősítheti. Úgy tűnik, hogy ez a helyzet áll fenn, ha a hozzákapcsolt fehérje hepatitisz B felületi antigén (HBsAg) [Christman és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sei., 79, 1815 (1982)], az Escherichia coli XGPRT fehérje [Ringold, Gordon és munkatársai, J. Molec. and Appl. Gen., 1, 165 (1981)] és egy DHFR/SV40 plazmid kombinációból származó endogén szekvencia [Kaufman és munkatársai, J. Molec. Bioi., 159, 601 (1982)]. A metotrexáttal szembeni rezisztencia biztosításának egyéb mechanizmusai közé tartozik a DHFR fehérje kötési affinitásának csökkentése, úgy, hogy kevésbé érzékeny metotrexátra [Flintoff és munkatársai. Somát. Cell. Genet., 2, 245 (1976)], ebben az esetben azonban úgy tűnik, hogy erősítés is fellép. Úgy látszik, hogy mind a vad típusú DHFR-re. mind pedig a kisebb kötési kapacitása folytán metotrexáttal szemben rezisztens DHFR-re vonatkozó géneket erősíti a metotrexát jelenléte. Ennek következtében. elvben, a találmány szerint felhasználjuk a DHFR szekvencia erősítésének a hozzákapcsolt fehérje kódoló szekvenciákra gyakorolt hatását egy olyan szabályozó mechanizmus biztosításához, amely a t-PA szekvenciák nagyobb mértékű termelését teszi lehetővé MTX jelenlétében vagy transzformált sejtek metotrexáttal való előkezelésével. A találmányt az alábbi példák segítségével részletesen ismertetjük, anélkül, hogy a találmányt a példákra kívánnánk korlátozni. A példákban olyan Escherichia coli gazdatenyészetet és CHO sejtvonalat használtunk, amelyek alkalmasak gazdasejt tenyészetekként a bevinni kívánt típusú DHFR fehétje kódoló szekvencia számára. A találmány szerinti eljáráshoz azonban más eukariotikus és prokariotikus sejtek is használhatók. 1. Humán t-PA gén termelése Escherichia coli törzsben 1. A. Az ábrák magyarázata Az 1. ábra a 10 %-os SDS (nátrium-dodecil-szulfát) poliakrilamid gél elektroforézisnél (PAGE) kapott radiogramm, amely emberi melanoma sejtekből 3 óra alatt in vivo kiválasztott, immunológiai úton kicsapott 35S-metioninnal jelzett fehérjét/fehérjéket mutatja be. A szekréció az aprotinin proteáz inhibitor jelenlétében (b mező) vagy távollétében (a mező) történt. A szövetekben előforduló plazminogén aktivátorra specifikus IgG-vel végzett immunológiai kicsapás után három sávot figyeltünk meg (a mező), amelyek molekulatömege közelítőleg 65000, 63000 és 35000 volt. A proteáz inhibitor jelenlétében azonban nem figyeltünk meg 35000 molekula tömegű anyagot. Nem vált ki termék preimmun szérum használata esetén (c mező). A 14C izotóppal jelzett standard fehérjeminták vándorlását és molekulatömegét az a mezőtől balra mutatjuk be. A 2. ábrán savas karbamid agaróz gélről elkülönített RNS frakciók immunológiai úton kicsapott transzlációs termékeinek gélelektroforézise látható. Egy fő sáv a 7. és 8. frakciónál figyelhető meg, kutya pankreász mikroszómák jelenlétében végzett lefordítás és a szövetekben megtalálható plazminogén aktivátorra specifikus IgG-vel végzett immunológiai kicsapás után. Ennek a sávnak a molekulatömege mintegy 63000 dalton. A 7. és 8. számú frakciókban vándorló mRNS mérete körülbelül 21-24S. A megfelelő gélekre vonatkozó mezők felett jeleztük a riboszóma RNS jelzők helyzetét, amelyeket az RNS karbamid gélen végzett elektroforézis és etidium-bromiddal való megfestéssel történő láthatóvá tétel után határozzuk meg. A 3. ábrán 96 tenyészet 32P-dTC( q)CA( q)TA(^)TCCCA (W-E-Y-C-D) mintával kapón hibridizációs képét mutatja be. 96 különálló transzformánst mikrotitráló lemezen tenyésztettünk, párhuzamos tenyészeteket készítettünk, és a tenyésztést nitrocellulóz membránon folytattuk. A tenyészeteket ezután elbontottuk, a bakteriális eredetű DNS-t rögzítettük, és a szűrőket a 32P-14-mer (W-E-Y-C-D) mintákkal hibridizáltuk. A szűrőkből mosással eltávolítottuk a hibridizálatlan mintát, majd röntgenfilmet exponáltunk a szűrők tartalmával. A kapott autoradiogram jellemzi a 48 szűrővel (4600 egymástól független tenyészet) kapott hibridizációs képet. Példaképpen E10 jelöléssel láttuk el 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
