200615. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az emberi szövetekben található plazminogén aktivátor és ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 200615 B 2 3.C. A felerősítés és a t-PA termelés mértéke A fenti alklónokat egy-egy 100 mm átmérőjű lemezen 2xl05 sejtszám mellett tenyésztettük 50 nM metotrexát jelenlétében a felerősítés elősegítésére. A fennmaradt sejtek a fenti vizsgálat során minden esetben körülbelül tízszeresét adták a szövetekben található plazminogén aktivátor felerősítetlen mennyiségének. Két ilyen kiónt választottunk ki a további vizsgálathoz, s ezek az 1-15, illetve 18B-9 jelölést kapták. Az 1-15 alklónt tovább erősítettük oly módon, hogy 2xl05 sejtet átvittünk 100 mm átmérőjű lemezekre, amelyek 500 nM metotrexátot tartalmaztak. Az így felerősített sejtek vizsgálatakor a t-PA termelésének további, körülbelül háromszorosra történő növekedését tapasztaltuk. A kvantitatív meghatározás alapján a termelt mennyiség 7x10^ egység/sejt/nap volt. Ezeknek a felerősített sejteknek egy részét 10.000 nM metotrexát jelenlétében tarottuk. Az 1-15 és a 18B-9 alklónt tovább vizsgáltuk, miután 1-2 hónapig az 1*. táblázatban megadott körülmények között tartottuk őket. A kapott eredményeket a 3. táblázat tartalmazza. 3. táblázat Sejtvonal Tenyésztési körülmények ng t-PA/ sejt/napx 1-15500 500 nM MTX 28,5x10-3 1-15500 500 nM MTX 26.0x10-3 1-15500 (-HGT táptalaj, MTX nélkül) 8.3x10“3 1-15500 (-HGT táptalaj, MTX nélkül) lS.OxlO--3 l-lSio.ooo 10 jiM MTX 29.3x10-3 1-1510.000 10 uM MTX 49.0xl0-3 18B-9 50 nM MTX 14.3x10-3 18B-9 50 nM MTX 14.4x10-3 18B-9 (-HGT táptalaj, MTX nélkül) 14.3x10-3 18B-9 (-HGT táptalaj, MTX nélkül) 14.4x10-3 1 (-HGT táptalaj, MTX nélkül) 1,0x10-3 1 (-HGT táptalaj, MTX nélkül) 0.7x10-3 x A táptalajban lévő t-PA-t a következőképpen vizsgáltuk kvantitatíve radioaktív immunológiai méréssel: A tisztított t-PA-t és melanoma sejtektől származó, tisztított, jódozott nyomjelzővel ellátott t-PA-t sorozathígításnak vetettük alá. és ezzel átfogtuk a 12.5—400 ng/ml koncentrációtartományt. A hígítást olyan pufferoldattal végeztük, amely foszfáttal pufferolt nátrium-klorid-oldatból áll (pH=7,3), s 0,5 % szarvasmarha szérum albumint, 0,01 % Tween 80-t és 0.02 % NaN3-t tartalmazott. A vizsgálandó táptalajminták megfelelő hígításait hozzáadtuk a radioaktív izotóppal jelzett fehérjékhez. Az antigéneket egy éjszakán át inkubáltuk szobahőmérsékleten nyúl anti-t-PA antiszérum IgG frakciója 1:10.000 arányú hígítása jelenlétében. Az antitest-antigén komplexet kicsaptuk kecske antinyúl IgG immungyöngyök (Bio- Rad) alkalmazásával végzett abszorpcióval. Az abszorpciót 2 órán át végeztük szobahőmérsékleten. A gyöngyökhöz nátrium-kloridot tartalmazó hígítószert adtunk, majd 10 percig centrifugáltuk 4 °C-on 2000 x g erősséggel. A felülúszó folyadékot elöntöttük, és mértük a csapadékok radioaktivitását. A koncentrációkat az összehasonlító standard mintához való viszonyítással állapítottuk meg. A sejtvonalakat a következők: az „1” sejtvonal az eredeti négy kióntól származó, felerősítetlen klón. Az „1-15500” az „1” sejtvonal felerősített alklónja, ahol a felerősítés kezdetben 50 nM metotrexát koncentrációval történt, majd az így kapott 1-15 alklónnal további felerősítést végeztünk 500 nM MTX segítségével. Az „l-15io.ooo” az 1-15500 alklónja, amelyet tovább erősítettünk 10.000 nM metotrexát jelenlétében. A 18B-9 sejtvonal az eredeti négy klón egyikének alklónja, amelyet 50 nM metotrexát alkalmazásával erősítettünk fel. Valamennyi felerősített sejtnél megnövelt mértékű t-PA termelést tapasztaltunk a felerősítetlen sejttenyészettel elért t-PA termeléshez képes. Azonban még a felerősítetlen tenyészet is több t-PA-t termel mint 0.5 pg/sejt/nap. A felerősítés eredményeként a termelés eléri az 50 pg/sejt/nap értéket. Gyógyszerkészítmények A találmány szerinti vegyületeket önmagában ismert módon gyógyászatilag értékes készítményekké alakíthatjuk. Ennek során az emberi szövetekben található plazminogén aktivátort gyógyászatilag elfogadható vivőanyaggal/anyagokkal keverjük össze. Az alkalmas vivőanyagokat és a készítményformákat, amelyek más emberi eredetű fehérjét, például emberi szérum albumint is tartalmazhatnak, például a Remington’s Pharmaceutical Sciences (szerkesztő: E. W. Martin) ismerteti. A gyógyszerkészítmények hatékony mennyiségű találmány szerinti fehérjét tartalmaznak alkalmas mennyiségű vivőanyag mellett. Például a találmány szerint előállított, az emberi szövetekben található plazminogén aktivátort parenterálisan beadhatjuk olyan betegeknek, akik kardiovaszkuláris megbetegedésben szenvednek. Az adagolás hasonló lehet, mint amit jelenleg alkalmaznak más kardiovaszkuláris, trombolitikus szerek klinikai vizsgálatánál, például 440 nemzetközi egység minden kg testsúlyra. Ez az intravénás kezdő dózis, s ezután folyamatos intravénás infúzió következhet 440 NE/kg/óra dózisban 12 órán át, tüdőembóliában szenvedő betegeknél. Például parenterálisan egy olyan gyógyszerkészítmény alakjában adhatjuk be a lényegében homogén, az emberi szövetekben található plazminogén aktivátort, amelynél egy ampulla 25.000 NE aktivitású plazminogén aktivátort, 25 mg mannitot és 45 mg nátrium-kloridot tartalmaz. Ebből 5 ml steril vízzel készíthetünk befecskendezhető oldatot, intravénás beadáshoz pedig alkalmas mennyiségű 0,9 %-os nátrium-klorid-oldattal (injekciós minőség) vagy 5 %-os dextróz-oldattal (injekciós minőség) keverjük össze. Az emberi szövetekben található, rekombinált plazminogén aktivátor részletes leírása A példákban előállított emberi t-PA szerkezetét eléggé részletesen tanulmányoztuk, a gént kódoló szekvencia vizsgálatával és fehérje-biokémiai módszerekkel. A fehérje szerkezetével kapcsolatos jelenlegi ismereteinket a 12. ábrán mutatjuk be. Collen és munkatársai (88) korábban azt is kimutatták. hogy kétláncú emberi t-PA képződik egy egyláncú molekula proteolitikus hasításakor. A keletkező két 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 19
