200609. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyógyászatilag aktív foszfino-szénhidrogén csoport (VIII) csoporthoz tartozó fémekkel képezett komplexei és a vegyületeket tartalmazó tumorellenes készítmények előállítására
1 HU 200609 B A logaritmikusán növő sejteket enyhe tripszínezéssel gyűjtjük össze és 4000 sejtet adunk mindegyik 96- -üregű mikrotiter lap (Costar) üregébe. A lemezeket 37 °C-on 5 %-os széndioxidban inkubáljuk egész éjjel, és hagyjuk, hogy a sejt a lemezhez kapcsolódjon. Ezután a sejteket fémkomplexszel vagy ciszplatinnal kezeljük és 72 óra hosszat inkubáljuk. A lemezeket felfordítjuk és a táptalaj, a hatóanyag és a levált sejtek eltávolítása céljából rázzuk. Hozzáadunk 10 %-os formaiint foszfáttal pufferezett sóoldatban és a sejteket 10 percig fixáljuk. A fixálószert eltávolítjuk, a lemezeket levegőn szárítjuk, 0,075 %-os kristály ibolyával 15 percig megfestjük, kétszer mossuk és levegőn szárítjuk. A festéket 0,2 ml 0,1 mólos ecetsav és etanol 1:1 arányú 5 elegyével oldjuk és az optikai sűrűséget Dynatech MR600 mikrotiter lemezolvasóval határozzuk meg. Az IC 50 értékeket az abszorpciós adatok linerális regressziós adatainak analízisével számítjuk ki. Az in vitro citotoxicitás teszt eredményeit több vegyületre vonatkozólag az I. táblázat mutatja. 10 I. táblázat a) IC 50 (mcg/ml) Képletszám Vegyületszám DI D1 A Xi X2 n Y M Bló HCT 116 2 TNO 306 P P (CH2)2--- ---2 Cl Pd(II) 57 — 3 TNO 345 P P (CH2)2 — — 2 NO3 Pd(H) 4,0 19,6 4 TNO 347 P P (CH2)2 N03 — 1 NO3 Co(II) 413 500 6 TNO 357 P P cisz-CH=CH — — 2 Cl Pd(H) 27,7 13,1 7 TNO 376 P P (CH2)2 Br — 1 Br Pd(II) 0,7 6,3 a) a sejtnövekedést 50 %-kal csökkentő koncentráció Patkány leukémia elleni hatás Valamennyi fémkomplexet vizsgáltuk P388 patkány leukémia tumorellenes hatásra. Egy-egy kiválasztott vegyületet megvizsgáltunk L1210 patkány leukémia elleni tumorellenes hatásra. Néhány kiválasztott ve- 30 gyületet megvizsgáltunk a ciszplatinra rezisztens L1210 patkány leukémia elleni antitumor hatásra, és az L1210 patkány leukémia egy szubvonalának tumorellenes hatására is. (L1210:DDP). 20 g súlyú CBFi egereket beoltunk intraperitoneálisan 10° P388 leuké- 35 mia, L1210 leukémia vagy L1210:DDP leukémia ascites sejtekkel, a tesztrendszertől függően. A gyógyszeradagolást a tumorbeépítés utáni napon kezdtük valamennyi tesztrendszerben. A komplexeket különböző dózisszinten adagoltuk, intraperitoneális injekcikóval. 40 4-6 egérből álló csoportokat használtunk minden dózisszinten és ezeket csak az első napon kezeltük a komplexszel. 10 fiziológiai sóoldattal kezelt kontroll egérből álló csoportot is használtunk minden kísérletnél. Pozitív kontrollként minden kísérletben egy egy 45 ciszplatinával kezelt csoportot alkalmaztunk. Az egereket a kezelés előtt lemértük, az ötödik vagy hatodik napon ismét lemértük és a toxicitás mértékéül szolgált az átlagos súlyváltozás. Mortalitás szempontjából naponta megfigyeltük az állatokat, és kísérleteket 30 nap 50 múlva fejeztük be. Az antitumor hatást a T/C %-ra alapítva határoztuk meg. A T/C % a gyógyszerrel kezelt csoport átlagos túlélési ideje a fiziológiailag kezelt kontrollcsoport átlagos túlélési idejéhez viszonyítva szorozva 100-al. A fiziológiai sóval kezelt egerek átla- 55 gos túlélési ideje általában 9 nap P388 leukémia esetén, és 7 napos az L1210 és az L1210:DDP leukémia esetén. A komplexet akkor tartjuk hatásosnak, ha a T/C % értéke 125. A n. és Ha. táblázatok a patkány leukémia elleni antitumor hatás kiértékelését tartalmaz- 60 zák, az egyes vegyületeknél megadtuk az elért maximális T/C %-ot és azt a dózist, amely ezt a hatást kiváltotta. B16 melanoma elleni hatás A B16 melanoma ellen számos fémkomplexet értékeltünk ki antitumor hatásra. Csoportonként 10 BDFi egeret beoltottunk intraperitoneálisan 0,5 ml 10 tömeg/térfogat%-os B16 melanoma kásával. Az intraperitoneális kezelést a fémkomplexekkel az implantálás után egy nappal kezdtük meg, és összesen 9 napig naponta folytattuk. 4-5 dózist teszteltünk minden vizsgált vegyület esetében. Minden kísérletnél beiktattunk egy fiziológiai sóoldattal és egy ciszplatinnal kezelt kontroll csoportot. Az egereket naponta megfigyeltük túlélés szempontjából, és 60 nap múlva fejeztük be a kísérleteket. A fiziológiai sóoldattal kezelt kontroll egerek átlagos túlélési ideje 20-26 nap. A gyógyszerrel kezelt átlagos túlélési idő a kontrolihoz képest a T/C %, ezt az értéket használtuk az antitumor hatás mérésére. A komplex akkor tekinthető hatásosnak, ha a T/C % értéke 125. A fémkomplexek teszteredményeit a III. táblázatban foglaltuk össze. Ebben megadtuk az egyes komplexekkel elért maximális T/C %-ot, és a hatást kiváltó dózist. Gyógyszerelőállítás Az in vitro citotoxicitás vizsgálatokra a gyógyszereket oldékonyságuktól függően feloldottuk vagy szuszpendáltuk 0,9 %-os nátrium-klorid oldatban. Alkalmanként 5 %-os dextróz vizes oldatot, vagy 10 %-os dimetil-szulfoxid 0,9 %-os nátrium-kloriddal készített oldatát használtuk. A vegyületeket in vivo kezelésre úgy állítottuk elő, hogy feloldottuk vagy szuszpendáltuk vízben minimális mennyiségű Tween 80 hozzáadása mellett. Előállítási példák A következő példákkal a vegyületek kémiai előállításának részleteit kívánjuk illusztrálni, valamennyi reakciót száraz nitrogén atmoszférában végeztük. Az 1.2- -bisz(difenil-foszfino)-etán a következőkben difosz. az l-difenil-foszfmo-2-difenil-arzéno-etán arfosz, és a cisz-l,2-bisz(difenil-foszfino)-etilén pedig dppen. 4
