200560. lajstromszámú szabadalom • Eljárás diagnosztikai célú tromboplasztin-reagens előállítására
1 HU 200560 B 2 A találmány tárgya új eljárás diagnosztikai célra alkalmas, nagytÍ6ztaságú tromboplasztin-tartalmú reagens-sorozat előállítására, állati szövet vértelenitése, homogenizálása, oldószeres extrahálása, az inkubált elegy centrifugával történő elválasztása, a felülúszóból higitási sorozat készítése és az oldatok liofilezése útján. Ismert, hogy az egészségügyi hálózatban - világszerte - széles körben foglalkoznak véralvadási vizsgálatokkal. Cél a vérzékenység, illetve a trombózis-hajlam felismerése. Különösen fontos az orális antikoagulánskezelésben (így például Syncumar-kezelésben) részesülő betegek rendszeres laboratóriumi ellenőrzése. Erre a célra a prothrombin-idó megbízható mérése alkalmas. Az eddig ismert, úgynevezett globális tesztek segítségével az alvadási folyamatban résztvevő több komponens plazmatikus szintjét határozzák meg. A leggyakrabban végzett ilyen vizsgálat a prothrombin-idő mérése, az ú.n. Quick-teszt (A. J. Quick: Am. J. Physiol. 18, 260 /1937/). A különböző gyári készítményekkel (tromboplasztinokkal) meghatározott prothrombin ráták, azaz a vizsgált és a kontroll plazma prothrombin idejének hányadosa, jelentősen eltérhetnek, így az eredmények egységes értékelése igen nehéz. Ezért az ilyen reagens-készleteknél az ú.n. ISI (International Sensitivity Index) ismerete ma már elengedhetetlen követelmény. (Lásd: Boda Z. és Rák K.: A Syncumarral kezeltek laboratóriumi ellenőrzése. Orvosi Hetilap, 125, 1509 /1984/). A korszerű méréstechnikák és a fokozódó igények olyan magas tisztaságú tromboplasztin előállítását igénylik, melynek ISI-értéke 1,4-1,6 közötti érték (lásd: K. Denson: Thromboplastin - sensitivity, precision and other characteristics. Clin. Lab. Haemat. 10, 315 /1988/). Ezen utóbbi követelménynek a legtöbb laboratórium által jelenleg is használt, állati szövetekből készített reagens-készletek (például a Goedecke cég .Simplastinja", a Hyland cég .Liquid Thromboplastinja*, a Solco cég .Thrombokinasa *) egyike sem felel meg. Ismert, hogy ezek a készítmények az általánosan használt, ú.n. acetonos eljárással készülnek. A korábbi módszerek jó összefoglalóját adja K. Denson (The preparation of general reagents and coagulation factors. In: Human blood coagulation; Haemostasis and Thrombosis. Kiadó: Rosemary Biggs, Oxford, 1972 /589-601. old./) munkája, valamint a 169 076 sz. csehszlovákiai szabadalmi leírás. A találmány célja tehát olyan tromboplasztin-reagenst tartalmazó diagnosztikai-készlet elóállitása, amely a kumarinok által befolyásolt alvadási faktorok szintjének csökkenését kellő érzékenységgel jelzi, ISI-je pontosan ismert, igy a hazai kumarin-terápia laboratóriumi kontrolljának egységes eszköze lehet. Kísérleteinkben meglepő módon azt találtuk, hogy a kívánt cél jól megközelíthető, ha az eddigi tromboplasztin-készítményeknél általánosan használt acetonos extrahálás helyett célszerűen ionmentes vizes oldatot használunk a szövetek extrakciójára. Felismertük azt is, hogy az optimális tromboplasztin-aktivitás érdekében egy sajátos arányú, nevezetesen 0,5-2,5 : 0,7 : 3,0 tömegarányú szövet-folyadék tömegarányt kell alkalmazni. Szignifikánsan továbbjavitja az eredményeket, ha inert-gézzal végrehajtott oxigén-mentesitést végzünk, valamint a tartós védőhatás eléréséhez az eddig ismert eljárásoknál nem használt glutationt és tokoferolt alkalmazunk. A találmány szerinti új, előállítási eljárással nyert, prothrombin-idő meghatározására alkalmas tromboplasztin reagens előnye, hogy az eljárás paramétereinek megfelelő megválasztásával (ionmentes vizes oldat, optimális szövet-folyadék arány, oxigénmentes közeg megfelelő biztosítása, tartós védőhatás biztosítása, optimális ISI-érték elérése) az eddig használt reagensekhez képest megbízhatóbb, egységesen értékelhető, nemzetközileg is elfogadható eredményt ad. A fentiek alapján a találmány tehát új eljárás diagnosztikai célra alkalmas, nagytisztaságú tromboplasztin-tartalmú reagens-sorozat előállítására, állati szövet vértelenitése, homogenizálása, oldószeres extrahálása, az inkubált elegy centrifugával történő elválasztása, a felülúszóból higitási sorozat készítése és az oldatok liofilezése útján, olyan módon, hogy a kiindulási anyagként használt szövet-homogenizátumot 0,5-2,5 : 0,7-3,0 tömegarányban 0,5-5,0 g/1 fenolt, 0,1-2,0 mmol/1 glutationt és 0,01-0,2 mmol/1 tokoferolt tartalmazó, inert gázzal oxigénmentesitett, ionmentes vizes oldatban 20-40 percen át 35-40 °C-on inkubálással aktiváljuk, az elegyet 20-30 órán át 2-8 °C-on hűtve tároljuk, majd az inkubált elegyet ismert módon centrifugálva szétválasztjuk, a felülúszóból ismert módon fiziológiás sóoldattal higitási sorozatot készítünk, majd a kapott nagytisztaságú reagens-mintákat ismert módon liofilizáljuk. Egy előnyös változat szerint a szövethomogenizátum extrahálásánál 0,9-1,1 : 1,1-1,3 szővet-folyadék-tömegarányt alkalmazunk. A találmány szerinti eljárásban legkedvezőbbnek az bizonyult, ha az aktiválásra használt vizes oldatban a fenol koncentrációját 5 g/1, a glutation koncentrációját 1 mmol/1 és a tokoferol koncentrációját 0,1 mmol/1 értéknek választjuk. A találmány szerinti reagens-sorozat előállításét az alábbi kiviteli példán mutatjuk be: 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
