200488. lajstromszámú szabadalom • Eljárás de-mannozil-teikoplanin-származékok előállítására
1 HU 200488 B 2 Az említett törzseket a szokásos süllyesztett levegőztetett körülmények között tenyésztjük, emészthető szén- és nitrogénforrást valamint szervetlen sókat tartalmazó táptalajban. Általában az említett kiindulási anyagot a Nocardia 5 oríentalis NRRL 2450 vagy a Streptomyces candidus NRRL 3218 törzsek tenyészetéhez adjuk olyan időpontban, amely az oltás időpontja után 18 órától addig terjedhet, míg a tenyészet a maximális növekedést eléri, azonban a beoltás utáni 24-72. órában történő adagolás, legalábbis néhány esetben előnyös. A reakcióidő, azaz a kiindulási anyag és a mikrobiális tenyészet érinkezésének időtartalma a végtermék kinyerése előtt, 48 és 140 óra között változhat, az alkalmazott speciális körülményektől függően. Azonban mivel a reakció lefutását jól ismert módszerekkel lehet követni, például a kiindulási anyag mennyiségének csökkenését követve, és/vagy a végtermék mennyiségének növekedését követve HPLC- vel, ezért a gyakorlott kutató könnyen képes meghatározni hogy a reakció mikor tekinthető teljesen lefutottnak és a kinyerési eljárás elkezdhető. A Nocardia oríentalis NRRL 2450 vagy Streptomyces candidus NRRL 3218 növekedésben lévő tenyészetének használata helyett használhatjuk ezek bármely olyan mutánsának vagy variánsának tenyészetét, amely még képes az említett kiindulási anyagban lévő fenolos rész és a mannóz rész közötti glikozidos kötés elhasításával a találmány szerinti de-mannozilezett vegyületek előállítására. Ä jelen találmány szerinti bármely eljárás, amely ilyen mutánst vagy variánst alkalmaz, a jelen találmány oltalmi körébe tartozik. A jelen találmány szerinti vegyületeket úgy is előállíthatjuk a találmány szerinti eljárással, hogy az említett de-mannozilezésre képes tenyészetek micéliumát használjuk, izotóniás sóoldatban, célszerűen NaCl-ben mosva, hogy ne roncsoljuk a micélium említett vizes oldatát. Mosás után a micéliumot kényelmesen felszuszpendáljuk egy fiziológiailag elfogadható közegben. A mosott micéliumos eljárást arra használhatjuk, hogy a reagáltatandó teikoplanin vegyületek menyiségét megnöveljük, az optimális átalakítási hatásfok megtartása mellett. Az is lehetséges, hogy az átalakítást sejtmentes preparátummal végezzük a sejteket például ultrahanggal feltárva. Az antibiotikumok kinyerését a reakcióközegből ezután önmagában jól ismert technikákkal végezzük, idetartozik az oldószeres extrahálás, kicsapás folyadékokkal vagy a oldat pH-jának megváltoztatásával, megoszlási kromatográfia, fordított fázisú megoszlási kromatográfia, ioncserés kromatográfia, affmitás-kromatográfía és hasonlók. Egy előnyös eljárásban immobilizált D-Alanil-D-alaninnal végzett affinitás-kromatográfia után különböző pH-n végezzük az elválasztást. A jelen elválasztási eljárásban használható immobilizált D-alanil-D-alanint a 122 969 sorszámú E.RA. bejelentésben írnak le. Ebben a kinyerési eljárásban az előnyös töltet a D-Alanin, ellenőrzött pórusméretű keresztkötéses polidextránhoz kapcsolva. A reakció-elegyet közvetlenül szűrés után vagy egy előzetes tisztítási eljárás után affinitás-kromatográfiának vethetjük alá. Ez az utóbbi eljárás magában foglalja a teljes közeg lúgosítását, előnyösen pH 8,5 és pH 11 között, majd adott esetben egy szűrési segédanyag jelenlétében történő szűrést. Az éles szűrlet pH-ját ezután 7 és 8 közé állítjuk, majd immobilizált D-Alanil-D-Alaninon végzett affinitás-kromatográfiának vetjük alá, vagy oszlopban vagy bekeverve. Míg az anyag pH 7-8 között kötődik az affinitás töltethez, a leoldást bázikusabb pH értéteknél végez- 10 zük (előnyösen pH 9,0 és 10,5 között) vizes lúg segítségével. Ez a vizes lúg lehet ammónia, illékony amin, alkáli- vagy alkáli-földfém-hidroxid, vagy egy bázikus puffereit oldat, igény szerint poláros szerves oldószer, úgymint egy vízzel elegyedő poláros oldó- 15 szer jelenlétében. A poláros, vízzel elegyedő oldószerekre jellemző példák: vízben oldódó alkoholok (úgymint metanol, etanol, izopropanol, n-butanol), aceton, acetonitril, alacsony szénatomszámú alkanoátok (például etilace- 20 tát), tetrahidrofurán, dioxán és dimetilformamid és ezek keveréke; az előnyös poláros, vízzel elegyedő oldószer ebben az esetben az acetonitril. Miután a szennyeződéseket eltávolítjuk az oszlopot vizes, 4-9 közötti pufferrel mosva, amely tartalmazhat 25 sókat (pl. ammónium-formiátot) karbamidot és/vagy vízzel elegyedő oldószereket, a de-mannozil teikoplanin antibiotikumot az előzőkben említett eluáló keverékkel leoldjuk. Az eluátumot HPLC-vel analizáljuk és a kívánt anyagot tartalmazó frakciókat 30 egyesítjük. Ennek az eluátumnak a pH-ját 7,0-7,5-re állítjuk szerves vagy ásványi savval. Az eluátumot ezután betöményítjük és sómentesítjük. 35 Egy kényelmes sómentesítési eljárás során az antiobiotikum-tartalmú vizes oldatot szilanizált szilikagél oszlopra visszük, desztillált vízzel mossuk, majd egy fentiekben meghatározott poláros vízzel elegyedő oldószer és víz keverékével leoldjuk. 40 Egy másik módszer szerint a de-mannozilezett teikoplanin származék(ok) vizes oldatát szimultán koncentráló/sómentesítő eljárásnak vetjük alá, olyan membránon keresztül ultraszűrve, amelynek a nominális mól tömeghatára (NMWL) 1000 dalton vagy 45 kevesebb. A fenti eljárásból kapott oldatot liofilezzük és a kinyert anyagot további tisztításnak vetjük alá. Néhány esetben, főleg nagymennyiségű preparátumoknál az említett tisztítást előnyös két lépésben 50 végrehajtani. Az első lépésben a teikoplanin komplex egyes komponenseinek az elválasztására a 4 542 018 sorszámú USA szabadalomban leírt általános fordított fázisú kromatográfiás eljárást használjuk. Az említett eljárás egyik kivitelezési módjában a liofilezés során 55 kapott de-mannozil teikoplanin származék(ok)at ammónium-formiát/acetonitril keverékében oldjuk, pH- ját nátrium-hidroxiddal 7,5-re állítjuk, és a kapott oldatot szilanizált szilikagél oszlopon bocsátjuk keresztül, majd az oszlopot ammónium-formiátban oldott 60 acetonitril lineáris gradiensével eluáljuk. Az eluátumot HPLC-vel vizsgálva követjük és a kívánt anyago(ka)t tartalmazó frakciókat összesítjük, majd csökkentett nyomáson bepárolva kapjuk a kívánt szilárd anyagot. Ez az eljárás használható a teikoplanin komplex 65 egyes de-mannozil származékainak elválasztására is, 4
