200487. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új demetil-avermektin-származékok előállítására
1 HU 200487 B 2 konokat termel, szinefungin jelenlétében fokozott mennyiségű B-avermektin aglikonokat állított el<5. Hasonlóképpen a S. avermitilis 08, mely törzsre a magas avermektintermelés jellemző, az O-metiltranszferázt gátló szinefungin jelenlétében csak olyan avermektineket termelt, melyeknél az ágiikon C-5 helyén és az oleandróz cukorrészen hiányzottak az oxi-metil-csoportok. A S. avermitilis mutagén kezelésével olyan mutánsok állíthatók elő, melyeknél hiányzik az elágazó láncú-2-oxo-dehidrogenáz aktivitás. Ezek a mutánsok már nem képesek jelentős mennyiségű természetes avermektineket termelni, ha RCOOH általános képletű- ahol R jelentése izopropilcsoport vagy (S)-szek-butil-csoport - vegyület, vagy a fermentációs folyamatok során ilyen RCOOH savvá átalakulni képes vegyület nincs a tenyészetben. Meglepő módon azonban ezek a mutánsok természetes vagy nem-természetes avermektineket termelnek, ha a fermentációt hozzáadott RCOOH általános képletű - ahol R jelentése izopropilcsoport, (S)-szek-butilcsoport vagy más, itt tárgyalt csoport - vegyület, vagy azzá átalakulni képes előanyag jelenlétében végezzük. Még meglepőbb, hogy az itt ismertetett mutánsok, melyek nem rendelkeznek az elágazó láncú-2-oxosav-dehidrogenáz aktivitással és, amelyek nem tudják lebontani az L-izoleucint, L-leucint vagy L-valint, sokféle vegyületet képesek felhasználni nem-természetes avermektinek bioszintézisénél, miközben természetes avermektineket nem termelnek. Mint már említettük, a természetes avermektinek nyolc megkülönböztethető, de egymással szoros rokonságban levő vegyület keverékeként keletkeznek, melyek az (I) általános képlettel jellemezhetők, ahol R jelentése izopropilcsoport vagy (S)-szek-butilcsoport. Noha ezek lényegében tisztán előállíthatok, (lásd 4 429 042 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom), az eljárás legjobb esetben is, nagyon munkaigényes. A nem természetes avermektinek EP 214 731 számú szabadalom szerinti előállításánál különböző mennyiségben ugyancsak keletkezhetnek bizonyos természetes avermektinek, a felhasznált S. avermitilis törzsek sejtjeiben levő elágazó láncú-2- -oxosav-dehidrogenáz, valamint az L-valin és L-izoleucin jelenlétének köszönhetően. A jelen találmányt megelőzően ismert S. avermitilis törzsek szinefungin - egy S-adenozil-metionin analóg- jelenlétében végzett tenyésztésével A és B típusú demetil-avermektineket állítottak elő. A kívánatos cél az volt, hogy lehetőség nyíljon arra, hogy tetszés szerint lehessen - akár természetes, akár nem-természetes - avermektineket vagy demetil-avermektineket termelni, ezáltal csökken a komponensek száma a keverékben, megnő a tisztasága a kívánt avermektinnek, és egyszerűbbé válik a kinyerési eljárás. Az előállított vegyületek újak és parazitaellenes hatásúak, ezenkívül értékes közbenső termékek hatékony avermektin-származékok előállítására és kinyerésére. A találmány tárgya eljárás az (I) általános képletű- ahol a szaggatott vonal jelentése adott esetben kettőskötés a 22-es és a 23-as szénatom között; R1 jelentése hidroxilcsoport, ha a kettőskötés hiányzik, és hidrogénatom, ha a kettőskötés jelen van; R2 jelentése (II) általános képletű diszacharidcsoport, melyen belül R4 és R5 jelentése hidrogénatom vagy metilcsoport, azzal a feltétellel, hogy legalább egyik jelentése hidrogénatom; R4 jelentése hidrogénatom vagy metilcsoport; R jelentése a-helyzetben elágazó, 3-8 szénatomszámú alk.il-, 3-8 szénatomszámú alkenil- vagy 3-8 szénatomszámú cikloalkil-csoport, az izopropil- és szek-butil-csoport kivételével -parazita-ellenes demetil-avermektinek előállítására oly módon, hogy Streptomyces avermitilis ATCC 53568 törzset, vagy annak elágazó láncú 2-oxosav-dehidrogenáz aktivitással nem rendelkező és/vagy elágazó láncú aminosav-transzamináz aktivitással nem rendelekező mutánsát vagy variánsát adott esetben szinefungin jelenlétében tenyésztjük. Az elágazó láncú 2-oxosav-dehidrogenáz aktivitással nem rendelkező S. avermitilis törzseket avermektint termelő S. avermitilis törzsek, különösen S. avermitilis ATCC 31267, ATCC 31271, ATCC 31272 vagy az NCIB 12121 törzsek mutációjával állítjuk elő. A mutánsok nem képesek természetes avermektineket termelni, hacsak izopropil- vagy (S)-szek-butil-csoportot viselő zsírsavat vagy annak előanyagát nem adjuk a mutáns táptalajhoz. Aerob körülmények között, megfelelő primer savat vagy a fermentációs folyamatok során azzá átalakulni képes előanyagot tartalmazó vizes táptalajon tenyésztve, a mutánsok természetes és nemtermészetes avermektineket termelnek. Ha a fermentációt szinefungin jelenlétében végezzük, demetilált A és B avermektinek keletkeznek, melyeknél a diszacnarid rész 3’ és/vagy 3” helyén hiányzik az egyik vagy mindkettő metoxicsoport, a nevezett helyen vagy helyeken hidroxilcsoportot találunk. Az elágazó láncú-2-oxosav-dehidrogenáz aktivitással nem rendelkező mutánsokat a jelzett széndioxid vizsgálattal választhatjuk ki a mutagenizált telepek közül. Az eljárás azon alapszik, hogy az elágazó láncú-2-oxosav-dehidrogenáz aktivitással nem rendelkező mutánsok permeabilizált sejtjei nem termelnek 14C02-ot a [14C-l]-2 -oxo-izokapronsav vagy a [ l4C-1 ]-2-oxo-3-metil-valeriánsav szubsztrátból. Meglepő és váratlan volt, hogy az itt leírt, elágazó láncú-2-oxosav-dehidrogenáz aktivitással nem rendelkező mutánsok megőrizték avermektint termelő képességüket, különösen a nem-természetes avermektineket illetően, és szinefungin jelenlétében demetil-avermektineket termelnek. A képesség elvesztése, hogy a mutáns a szokásos táptalajokon természetes zsírsavak koenzim-A származékait termelje, letális mutációhoz vezethetett volna, ha a membrán integritása az említett származékok függvénye, vagy, ha a 2-oxosav felszaporodása citotoxicitáshoz vezet. Nem vártuk továbbá a mutánsoktól, hogy acetil-koenzim-A-t és propionil-koenzim-A-t tudnak szintetizálni L-izoleucin- és L-valin degradatív metabolizmusával, minthogy ez igényli azt az enzimaktivitást, amivel a mutánsok nem rendelkeznek. Az a tény, hogy az avermektin bioszintéziséhez szükség van ezekre az acil-koenzim-A származékokra, arra a következtetésre vezetett, hogy a mutánsok nem-természetes avermektintermelése súlyosan sérült lesz, de meglepően nem ez a helyzet. Az „avermektin" vagy „avermektinek" kifejezést az (I) általános képletű vegyületekre használjuk, ahol 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
