200480. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az alpha-melanotropin nyíltláncú és gyűrűs analógjai előállítására
1 HU 200480 B dókat 280 nm hullámhossznál vizsgáljuk. A peptidet tartalmazó frakciókat egyesítjük, és fagyasztva szárítjuk, ily módon 35 mg Ac-[Nle4,DPhe7,Lys10.Glyl 'l-a-MSH-t-BNFfc.HCl képletű sót kapunk. Ezt a peptid-sót feloldjuk 3 ml vízmentes és szekunder aminoktól mentes (ninhidrinről csökkentett nyomáson ledesztillált) dimetil-formamidban, az oldathoz vízmentes dikálium-hidrogén-foszfátot adunk, majd a reakcióelegyet sójeges fürdőben 0 °C hőmérsékletre hűtjük, és hozzáadunk 17 pl difenil-foszforil-azidot. Ezután a reakcióelgyet 0 °C hőmérsékleten keverjük, majd az elegyet tartalmazó edényt átvisszük egy 12 ”C hőmérsékletű, hideg szobába. Itt a reakcióelegyet éjszakán át 12 °C hőmérsékleten keverjük, a reakció előrehaladását nagyfelbontású folyadék-kromatográfiás vizsgálattal követjük. E célra egy 25,0 cm x 4,6 mm méretű, Vydac oszlopot használunk, és eluensként 0,1 %-os trifluor-ecetsav-oldatot és acetonitrilt alkalmazunk. A gyűrűzárás lejátszódását a ninhidrines próbával is ellenőrizzük. Az így kapott Ac- [Nle4,Glu5,D-Phe7,Lys1 °Gly11 ]-a-MSH4-13NH2 képletű terméket - a reakciónak 10 %-os, vizes ecetsav-oldattal való befagyasztása után - úgy tisztítjuk meg, hogy az elegyet egy 80,0 cm x 1,0 cm méretű, P4-poliakriI-amid oszlopon sómentesítjük, eluensként 30 %-os ecetsavat használunk, majd a kapott anyagot félpreparatív nagyfelbontású folyadék-kromatográfiás módszerrel tisztítjuk. Ily módon 16 mg Ac-[Nle4,Glu5.D-Phe7.Lysl0,Gly11]-a-MSH4-i3NH2 képletű gyűrűs peptidet kapunk. [ctj5«92-= -57,8° (c=0,045, 10 % ecetsav), Ri-0,79 [ 1 -butanol/ecetsav/piridin/víz (15:3:10:12 tf)]. 12. példa ,_____ Ac-INIc4 .Glu-\D-Plie7 .Ly.d0l-a-MSH4-ioNH2 A cím szerinti vegyül etet 2,0 g Na-Boc-Lys-(Ne-2"4-Cl2Z)-p-MBHA képletű vegyületből, tehát az a-amino-csoporton tercier-butoxi-karbonil-csoporttal, és az epszilon-amino-csoporton 2,4-diklór-benziloxi-karbonil-csoporttal védett lizint hordozó p-metil-benzhidril-amin gyantából. amely grammonként 1,0 mmól, az a-amino-csoporton tercier-butoxi-karbonil-csoporttal, és az epszilon-amino-csoporton 2,4-diklór-benziloxi-karbonil-csoporttal védett lizint tartalmaz, kiindulva állítjuk elő. A cím szerinti vegyületet védett és gyantához kötött peptid formájában úgy állítjuk elő, hogy a fenti kiindulási anyaghoz stepwise módszerrel az alábbi sorrendben hozzákapcsoljuk a következő, az a-amino-csoporton tercier-butoxi-karbonil-csoporttal védett aminosavakat:- az a-amino-csoporton tercier-butoxi-karbonil-csoporttal. és az indol-gyűrűrendszer nitrogénatomján formilcsoporttal védett triptofán,- az a-amino-csoporton tercier-butoxi-karbonil-csoporttal. és a guanidinocsoporton p-toluol-szulfonil-csoporttal védett arginin,- az a-amino-csoporton tercier-butoxi-karbonil-csoporttal védett D-fenil-alanin, és- az a-amino-csoporton tercier-butoxi-karbonil-csoporttal, és az imidazolgyűrű nitrogénatomján p-toluol-szulfonil-csoporttal védett hisztidin. Az így kapott, Ac-His(Nim-Tos)-D-Phe-Ara(N8-Tos)-Trp(N'-For)-Lys(Ne-2,4-Cl2Z)-p-MBHA képletű, védett peptidláncot hordozó gyantát két részre osztjuk. A védett pentapeptidet hordozó gyanta egy 1,4 g súlyú (0,5 mmól) részletéhez hozzákapcsolunk először az a-amino-csoporton tercier-butoxi-karbonil-csoporttal védett glutaminsav-gamma-benzil-észtert, majd ezután az a-amino-csoporton tercier-butoxi-karbonil-csoporttal védett norleucint. Ily módon a cím szerinti peptid védettt, gyantához kötött formájához jutunk. Az utolsó aminosav hozzákapcsolása után az a-amino-csoportot védő tercier-butoxi-karbonil-csoportot lehasítjuk, az aminocsoportot semlegesítjük, majd all. példában leírt módon megacetilezzük. Ily módon az Ac-Nle-Glu(gamma-Bzl)-His(Nim-Tos)-D-Phe-Arg (N8-Tos)-Trp(Ni-For)-Lys(Ne-2,4-Cl2Z)-p-MBHAw képletű, védett peptidláncot hordozó gyantát kapjuk. Ennek a védett peptidet hordozó gyantának egy 1,0 g súlyú részletéről cseppfolyós fluor-hidrogénsav segítségével lehasítjuk a védőcsoportokat, és egyúttal a peptidláncot is lehasítjuk a gyantáról, majd a kapott terméket all. példában leírt módon dolgozzuk fel. Ily módon fehér színű, porszerű anyag formájában 356 mg nyers Ac-[Nle4,D-Phe7.Lys10]-a-MSH4-ioNH2 képletű peptidet kapunk. E nyers peptid 100,0 mg súlyú részletét a 11. példában leírt módszerekkel megtisztítjuk, ily módon 65 mg, a nagyfelbontású folyadék-kromatográfiás vizsgálat szerint tiszta Ac- [Nie4, D-Phe7.Ly s1 °]-a-MSH4-i 0NH2 képletű peptidet kapunk. E tiszta peptid egy 40 mg súlyú részletét a 11. példában leírt módon gyűrűbe zárjuk, ily módon 13 mg, a nagyfelbontású folyadék-kromatográfiás vizsgálat szerint tiszta_______ Ac-[Nle4,GÍu5,D-Phe7,Lys10]-a-MSH4-ioNH2 képletű vegyületet kapunk. [cx]59s12 * * * * * * * * * 22= -13,3° (c=0,07, 10 % ecetsav), Rp=0,89 [butanol/ecetsav/víz (4:1:5 tf. felső fázis)]. 13. példa --------------Ac-[Nle4 .Asjy5 JD-Phe7 .Lys,(>l-a-MSH4-./oNH2 A cím szerinti vegyületet védett és gyantához kötött formában úgy állítjuk elő, hogy 1,4 g (0.5 mmól) Boc-His(Nim-Tos)-D-Phe-Arg(NS-Tos)-Trp (Ni-For)-Lys-(Ne-2,4-Cl2Z)-p-MBHA képletű gyantához stepwise módszerrel hozzákapcsolunk először az a-amino-csoporton tercier-butoxi-karbonil-csoporttal védett aszparaginsav-ß-benzil-észtert, majd ezután az a-amino-csoporton tercier-butoxi-karbonil-csoporttal védett norleucint. Mindkét kapcsolást ugyanazzal a műveletsorral hajtjuk végre, amelyet a fentiekben a szilárd fázisú peptid-szintézissel kapcsolatban általánosságban leírtunk. Az utolsó aminosav hozzákapcsolása után a kapott termékről az a-amino-csoportot védő tercier-butoxi-karbonil-csoportot lehasítjuk, az aminocsoportot 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
