200438. lajstromszámú szabadalom • Eljárás metionin-szulfoxid-csoportot tartalmazó peptidek és fehérjék redukálására
7 Hü 200438 B 8 analízist 0,1%-os vizes trifluorecetsavas-oldattal, 45 °C-on, az elúcióhoz lineárisan növekvő CH3CN-grádienst alkalmazva végezzük. A mennyiségi analízist a 214 nm-nél mórt abszorpciós csúcsok területének meghatározásával végezzük. A trifluor-ecetsav(dimetil-szulfoxid)sósav-val kezelt GRFU-áSjMetíO27, Lys«-OH egy olyan peptidet eredményezett, amely a szintetikus úton előállított standard GRF(l-45)Met27, Lys45-OH-éval azonos kromatográfiás retenciós időt mutatott. A vizsgálat eredményei a 2. táblázatban vannak feltüntetve. 2. táblázat CRF( 1 -45)Met(OP tLyS^-OH redu kciója Idő GRF(l-45)Met17, Lys«-0H hozama perc % 5. 64 15. 92 30. 98 60. 93 65. 96 75. 97 90. 95 120. 93 180. 88 3. példa Glukagon MetfOß1 kezelése 1,32 mg glukagon MetíOJ^-et vízmentes trifluor-ecetsavval készített 1 mólos dimetilszulíid-oldat 660 /ul-ében feloldunk. Kezeletlen ellenőrző minta gyanánt szolgál az ebből az oldatból vett 30 jul-es alikvot, nitrogénáramban megszárítva és 1,2 ml 0,1%-os vizes trifluorecetsav-oldatban szolubilizálva. A peptid(trifluor-ecetsav)dimetil-szulfid oldatot 6 részre osztjuk. Az oldatrészletekhez külön- 5 bözó mennyiségben koncentrált sósavat és triptofánt adagolunk, az oldatokat erőteljesen keverjük, és azután 60 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. A triptofánt azért adjuk a rendszerhez, hogy ezáltal minimumra 10 csökkentsük a glukagonmolekula 25-ös helyzetében található triptofán aminosav lebomlását, Minden egyes oldatrészletből 60 pl-es alikvotokat veszünk és a reakciót nitrogénáramban történd gyors szárítással állítjuk le, 15 majd a szárítási maradékot 1,2 ml 0,1%-os vizes trifluorecetsav-oldattal szolubilizáljuk. A 60. perc végén további tőménysósav-mennyiséget adunk a megmaradt peptidoldatokhoz. A reakcióelegyeket erőteljesen megkeverjük, 20 majd szobahőmérsékleten keverés nélkül állni hagyjuk. 60 perccel a másodszori sósavhozzáadás után minden egyes oldatrószletből 60 /ul-es alikvotokat veszünk, melyeket nitrogénáramban megszáritunk és a fent leírt mó- 25 dón 0,1%-os vizes trifluorecetsav-oldattal (1,2 ml) feloldjuk. A kémiai módosítás mértékét nagyteljesítményű folyadékkromatográfia (HPLC) segítségével, DuPont Cs fordított fázisú, 0,46 x 25 cm méretű oszloppal határoz- 30 zuk meg. A kromatográfiás analízist 0,1 mólos, 7-es pH-jú ammónium-foszfát pufferban 45 °C-on, lineárisan növekvő acetonitril-gradienst megvalósító elúciós rendszerrel végezzük. A mennyiségei analízis a 214 nm-nél 35 mérhető abszorpciós csúcsterületek meghatározásával történik. A trifluor-ecetsav(dimetil-szulfoxidjsósavval kezelt glukagon Met(O)27 egy olyan peptidet eredményezett, amelynek kromatográfiás retenciós idejét azonosnak ta- 40 láltuk a szintetikus úton előállított standard glukagonéval. A vizsgálat eredményeit az alábbi 3. táblázatban tüntetjük fel. 3. táblázat A glukagon MetfOj^ redukciója Trp-konc., m13 * * * * * * *2 retenciós idő, perc HC1 konc., n glukagonkitermelés, %, maradék glukagon Met(O), % 0 60 0,1 38 10 0 60 0,1 40 8 0 120 0,2 28 2 0 120 0,2 25 1 10 60 0,1 68 7 10 60 0,1 66 7 10 120 0,2 58 1 10 120 0,2 59 1 100 60 0,1 75 17 100 60 0,1 76 15 100 120 0,2 83 1 100 120 0,2 81 1 *A glukagonra számított mólekvivalensekben kifejezve 2A dimetil-szulfid lM-os koncentrációban van jelen 6
