200345. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immunglobulin és albumin előállítására 2-etoxi-6,9-diaminoakridin és kromatográfia kombinációjával
5 HU 200345 A 6 mólos 5,2 pH-jú 1,5 milli Siemens vezetőképességű nátriuinacetát: 20 liter, 2) 200 liter 0,025 mólos 4,5 pH-jú 2,0 milli Siemens vezetőképességű nátriumacetát, 3) 150 liter 0,125 mólos 4,8 pH-jú 8,8 milli Siemens vezetőképességű nátriumacetát. A 2. pufferrel történő eluáláskor albumin frakciót nyerünk. Az albumin frakciót ezt követően 0,025 mólos 4,5 pH-jú 1,8 milli Siemens vezetőképességű nátriiimacetát puufferrel egyensúlyba hozott 16 liter CMSepharose FF jelű (Pharmacia készítmény) kationcserőlő gyanta oszlopra visszük fel, három lépésben eluálunk a következő pufferekkel: 1/172 liter 0,025 mólos 4,5 pH-jú 1,8 milli Siemens vezetőképességű nátriumacetát, 2/175 liter 0,11 mólos 5,5 pH-jú 6,0 müli Siemens vezetőképességű nátriumacetát,, 3) 75 liter 0,4 mólos 8,2 pH-jú 23 milli Siemens vezetőképességű nátriumacetát. A 2. puffernd kapott eluátum tartalmazza az albumin frakciót. Ennek pH- ját 1 mólos nátriumhidroxid vizes oldatával 6,5 pH értékre állítjuk, majd 0,05 mólos nátriumldorid oldattal egyensúlyba hozott Sephacryl S-200 jelű (Pharmacia készítmény) gélszűrőre visszük a gélről 0,3 mólos 7,0 pH-jú 4 milli Siemens vezetőképességű acetátpufferral eluálunk és az albumin frakciót 20% összfehérje tartalom eléréséig ultraszűrővel besűrítjük, majd a nátrium-ion tartalmat szilárd nátriumldorid adagolásával 130 mülimól/liter értékre a Ph-t 1 mólos sósav, vagy 1 mólos nátriumhidroxid vizes oldatával 7,0 értékre állítjuk be és stabilitáló szerként nátriumkaprilát oldatot adagolunk 0,04 mól/liter nátriumkaprilát végkoncentráció eléréséig, végül az oldatot sterilre szűrjük és palackozzuk, a palackozott albumin oldatot 10 órán át 60 *C hőmérsékleten pasztőrizáljuk. Halványsárga színű, 20% összfehérje tartalmú, 99% feletti tisztaságú albuminkészítményt kapunk, mely vírust nem tartalmaz. A készítmény stabü, állás után sem tapasztalható csapadék kiválás. 5 5. példa A 3. példa szerint nvert 2-etoxi-6.9-diammoakridin-mentes immunglobulin frakció Hl. frakciói kromatográfiás tisztítása A 3. példa szerint nyert 2-etoxi-6,9-diaminoakridinmentes immunglobulin oldathoz (II. frakció) KS 370 típusú (Pharmacia gyártmányú) készülékbe helyezett 0,02 mólos, 5,6 pH-jú, 1,4 milli Siemens vezetőképességű nátriumacetát pufferrel egyensúlyozott DEARG jelű (Pharmacia készítmény, öszszetétel: DEAE Sepharose Fast Flow: 60% Arginin Sepharose 4B: 40%) anioncserélő gyantán (16 liter) engedünk át és az átfolyó oldatot CM-Sepharose FF jelű (Pharmacia gyártmányú) 0,02 mólos, 5,6 pH- jú, 1,4 milli Siemens vezetőképességű nátriumacetát pufferrel egyensúlyozott KS 370 típusú készülékbe helyezett kationcserélő gyantára (16 liter) visszük fel. Az oszlopot 20 liter 0,02 mólos nátriumacetáttal, majd 30 liter 0,01 mólos glycinnel mossuk, majd az immunglobulint 0,15 mól glycint és 0,1 mól nátriumhidroxidot tartalmazó 9,0 pH-jú puffer oldattal eluáljuk. Az eluált immunglobulin frakció pH-ját 1 mólos vizes sósav oldattal 7,0 értékre állítjuk, majd ultraszűréssel 5,0% fehérje tartalomra koncentráljuk ezt követően szűréssel sterilizálunk. A nyert immunglobulin oldatot -25 *C hőmérsékleten tároljuk ampuüázásig. Az immunglobulin készítmény liofüizálva a Ph.Hg. VH előírásainak megfelelő. . Szabadalmi igénypont Eljárás immunglobulin és albumin előállítására 2-etoxi-6,9-diaminoakridin és kromatográfia kombinációjával vérplazmából a plazma ismert módszerrel gélszűrőn történő sómentesítésével, azzal jellemezve, hogy a sótalanított plazma pH értékét vizes tejsav oldattal áüandó keverés mellett 4,6—4,8 pH értékre, előnyösen 4,7 pH értékre állítjuk be és keverés közben az elegyhez 2-etoxi-6,9-diaminoakridin szuszpenzióját adagoljuk 7,2—7,8 pH érték, előnyösen 7,5 pH érték eléréséig, az elegyet legalább 15 percig előnyösen 30 percig keverjük, majd 20 perc állás után a csapadékról a felül úszót leszivatjuk, majd a kiindulási plazma térfogatával azonos mennyiségű vízzel felhígított csapadék, illetve a felülúszó pH értékét 4,0—4,2 pH értékre, előnyösen 4,1 pH értékre áüítjuk be vizes tejsav oldattal, majd keverés közben a kiindulási plazma térfogatára számított 2,2—2,8, előnyösen 2,4 tömeg/térfogat% aktív szenet adagolunk, majd a szenet az elegyből eltávolítjuk, a nyert oldatot membrán szűrőn önmagában ismert módon sterilre szűrjük, a kapott 2-etoxi-6,9-diaminoakridinmentes albumin-, illetve immunglobulin oldatot önmagában ismert kromatográfiás tisztítási eljárással tisztítjuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 4
