200342. lajstromszámú szabadalom • Enzimatikus eljárás L-2-amino-4-(hidroxi-metil-foszfinil)-vajsav előállítására
HU 200342 B tűk, 50 mmól/literes foszfátpuffer-oldattal (pH = 6,0) mostuk. A sejteket ultrahang kezeléssel (KUKOBATAINSONATOR, 1,5 A, 1 perc) elroncsoltuk, majd lecentrifugáltuk, és Így nyers enzimoldatot kaptunk. A nyers enzimoldathoz OMPB-t adtunk 100 pg/ml koncentrációban és L-aszparaginsavat 200 (Ag/ml koncentrációban. KontroUtesztt is folytattunk, amelyben 2-ketoglutársavat (2-KG) adagoltunk kontrollszubsztrátként a transzamináló reakcióhoz. Az enzimatikus reakciót 30 °C-on 2 óra hosszat hagytuk lefolyni, majd a reakcióoldatot 3 percig 100 °C-ra melegítettük a reakció leállítása céljából. A kapott reakcióoldat pH-ját hígított kénsavval 2 értékre állítottuk, és a reakcióoldatot lecentrifugálva megkaptuk a felülúszó oldatot. A felülúszó oldatban jelenlévő L-AMPB és a 2-KG-ből képződött glutamsav mennyiségét aminosav analizátorra határoztuk meg. A vizsgálatok eredményét a III. táblázat mutajta. 15 III. táblázat Szubsztrát Termék is termelt mennyisége (|i/ml) OMPB L-AMPB 23 2-KG Glu 67,9 (kontroll) 4. példa 1. Streptomyces hygroscopicus NP-50 törzzsel (FERM P-7804 vagy FRM BP-1368) beoltottunk 10 ml előzetes tenyészközeget (összetétel 2,0% oldható keményftő, 1,0% polipepton, 03% húskivonat, 0,05% dikálium-hidrogén-foszfát, pH = 7,0). A törzset 28 *C-on 24 óra hosszat rázató tenyészetben tenyésztettük. A kapott tenyészetet oltótenyészetként 2% mennyiségben tenyésztő tápközeg beoltására használtuk (összetétele 7,0% glükóz, 4,4% bactosoyton, (Difco, USA gyártmány), 0327% kálium-dihidrogén-foszfát, 0,0852% dinátrium-hidrogén-foszfát, 1,15% dodte TES, (kémiai nerc N- trisz(hidroxi-metil)-metil-2-amino-etánszulfonsa v), 0,0001% kobalt-klorid, pH = 6,0) és a tenyésztést 28 °C-on levegőztetés és keverés mellett végeztük. 2. Egy 250 ml-es Erlenmeyer-lombikba bemértük a fenti módon tenyésztett Streptomyces hygroscopicus (OMPB koncentráció 87 mg/ml, pH = 7,0), 40 ml vizes kereskdelmi nátrium-glutamátot (koncentráció 170 mg/ml) és 10 ml 1 mól/literes trisz-hidrokíorid puffer-odlatot (pH = 83). Az OMPB koncentrációja az oldatban körülbelül 26 mg/ml. Az enzimatikus reakciót 37 °C-o 24 óra hosszat enyhe rázás közben hagytuk lefolyni. Ezután a reakdóelegyet lecentrifugáltuk, és a kapott felülúszó oldatban aminosav analizátorral meghatároztuk a termelt L-AMPB mennyiségét, amelyet 14 mg/ml-nek találtunk. Párhuzamos kísérletekben amino-donorként 170 mg/ml koncentrációban adagolva L-alaint vagy nátrium-L-aszpartátot alkalmaztunk. Úgy találtuk, míg nátrium-L-aszpartát alkalmazásakor 13 mg/ml L-AMPBT képződött. 3. A 2. lépésben, nátrium-L-glutamát mint amino-donor alkalmazása mellett kapott reakcióelegy centrifugálásával előálh'tott felülúszó oldat 100 miét felvittük egy400 ml-cs oszlopra, amely töltetként Dovex 50 W x 2 (H+-forma) kationcserélő gyantát tartalmazott (Rohm and Haas gyártmány), majd vizes ammóniával eluáltuk. AZ eluátum L-AMPB- tartalmú frakcióit összegyűjtöttük és betöményítettük. A betöményített oldatot 150 ml-es anioncserélő gyantát tartalmazó oszlopon kromatografáltuk, amely töltetként Dowex 1x2 (CHjCOO'-forma) (Rohm and Haas gyártmány) tartalmazott. Az oszlopot vízzel mostuk, és 03 n vizes ccetsav-oldattal eluáltuk. Az eluátum L-AMPB tartalmú frakcióit csökkentett nyomáson szárazra pároltuk, majd vákuumban szárítottuk, így720 ml L- AMPB-t kaptuk fehér por formájában. A fehér port metanolból átkristályosítottuk. Az így kapott kristályokat szokásos módon elemeztük, azaz meghatároztuk az elemi összetételt, a fajlagos optikai forgatóképességet, olvadáspontot, IR-spektrumot, NMR-spektrumot és tömegsepktrumot. Megállapítottuk, hogy a kapott kristály azonos az autentikus L-AMPB mintákkal. 5. példa 1. - A 4. példa 1. lépése szerinti módon előállított Streptomyces hygroscopicus NP-50 törzs (FERM P-7804, FERM BP1368) tenyészetéből 20 ml-t egy 30 ml-es centrifugacsőbe helyeztünk és 10 percig 3000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk. A leülepedett sejteket 30 ml 50 mmól/l-es trisz-hidroklorid pufferben (pH = 83) szuszpendáltuk. Egy 250 ml-es Erlenmeyer-lombikba bemértük 20 ml sejtszuszpenziót, 30 ml vizes OMPB-oldatot (koncentráció 87 mg/ml, pH = 7,0), 40 ml vizes, kereskedelmi nátrium-L-glutamátot (koncentráció 170 mg/ml) és 10 ml 1 mól/l-cs trisz-hidroklorid oldatot (pH = 83). A kapott oldat OMPB-koncentrációja 26 mg/ml. Az enzimatikus reakciót 24 óra hosszat 37 *C-on enyhe rázás mellett hagytuk lefolyni Ezután a reakdóelegyet centrifugáltuk, és a kapott felólúszó oldatban meghatároztuk a LAMPB-tartalmaz aminosav elemzővel Úgy találtuk, hogy 15 mg/ml L-AMPB keletkezett. 2. A kapott, L-AMPB-tartalmú felülúszó oldat 100 ml-ét a 4. példa 3: lépése szerint kromatografáltuk egy 400 ml-es oszlopon, amely töltetként Dowex 50W x 2 (H+-forma) kationcserélő gyantát tartalmazott, amelyet vizes ammónia oldattal fejlesztettünk ki. Az L-AMPB-tartalmú frakciókat a 4. példa 3. lépése szerint kezeltük, így 750 mg LAMPB-t kaptunk fehér por formájában. 6. példa 1. A 4. példa 1. lépése szerinti módon előállított Streptomyces hygroscopicus NP-50 törzs (FERM P-7804, FERM BP-1368) tenyészetéből 20 ml-t egy 30 ml-es centrifugacsőbe helyeztünk és 10 perdg 3000 forulat/perc sebességgel centrifugáltuk. A leülepedett sejteket 30 ml 50 mmól/l-es trisz-hidroklorid pufferben (pH = 8,5) szuszpendáltuk. A kapott sejtszuszpenziót 10 perdg ultrahanggal kezeltük, és a kapott szuszpenziót 10000 fordulat/perc 16 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
