200342. lajstromszámú szabadalom • Enzimatikus eljárás L-2-amino-4-(hidroxi-metil-foszfinil)-vajsav előállítására
HU 200342 B igy szárai por formájába« kapjuk L-AMPB-t. A találmány szerint eljárással előállított L-AMPB ugyanolyan fizikai és kémiai tulajdonságokkal rendelkezik, mint az autentikus L-AMPB-minta, amely például a 47845/82 számú közzétett japán szabadalmi bejelentés szerint állítható elő. A találmány szerinti eljárással előállított L-AMPB továbbá ugyanolyan herbicid aktivitással rendelkezik, mint az ismert fermentációs úton előállított LAMPB. A találmány szerinti eljárást a következő példákkal szemléltetjük a korlátozás szándéka nélkül. 1. példa Az L-AMPB előállítását úgy végeztük, hogy különböző kereskedelemben kapható transzaminázokat OMPB-vel reagáltattunk, amelyet 50 mmól/l-es foszfát-puffer-oldatban (pH * 6) oldottunk, amely az amino-donor vegyületet tartalmazta. Transzamináz enzimként glutaminsav-oxálecetsav-transzaminázt (GOT) (Brödinger Mannheim Co., Ltd. gyártmánya) alkalmaztunk, amino-donorként (amino-csoport-adó szubsztrátként) L-aszparaginsavag (Asp) és L-glutaminsavat (Glu) adtunk hozzá, és feloldottuk a reakcióközegben. Másrészt, ha glutaminsav-, piroszőlősav-transzaminázt (GPT) alkalmaztunk (Böringer Mannheim Co. gyártmánya), a reakcióelegyben amino-donorként L-alanint (Alá) oldottunk. Ha a referencia tesztben glutaminsav-dehidrogenázt (GLDH) alkalmaztunk, amino-donorként ammónium-kloridot és NADH-t adagoltunk. Összehasonlítás céljából glutaminsav (Glu) termelését is megfigyeltük 2-ketoglutársavból (2-KG) (kontroll szubsztrátként) transzamináz segítségével. Az enzimatikus reakciót 30 °C-on 50 percig folytattuk, majd a reakcióelegyet 3 percre 100 °C-re melegítettük a reakció leállítása céljából A reakdóelegy vagy reakcióoldat pH-ját ezután hígított vizes kénsavval 2 értékre állítottuk, és lecentrifugáltuk. A képződött és a felülúszó oldatban jelenlevő L-AMPB és glutaminsav mennyiségét aminosav elemzővel határoztuk meg. Az eredményeket az I. táblázatban foglaltuk össze. 12 I. táblázat ■ Alkalmazott Szubszírát Amino-donor Reakciótermék enzim és vegyület és vegyület és és termelt mennyisége mennyisége (jLg/ml mennyisége jig/ml mennyisége jtg/ml GOT OMPB 100 Asp 1000 L-AMPB 2,8 (10 egység/ml) OMPB 100 Glu 1000 L-AMPB 3,7 2-KG 100 (kontroll) Asp 1000 Glu 109,3 GPT (4 egység/ml) OMPB 100 Alá 1000 L-AMPB 0,9 2-KG 100 Alá 1000 Glu 92,7 0,1-100 mg/ml értékre állítjuk be. A 4-(hidroxi-metil-foszfinil)-2-oxo-vajsav és az amino-donor vegyületek kezdeti mólaránya a vizes reakcióközegben, mielőtt a 4-(hidrojri-metil-foszfinil)-2-oxo-vajsav L-2-amino-4-(hirdoxi-metil-foszfmil)-vajsawá tör- 5 dik L'10 és 10:1 közötti. Ha a 4-(hidroxi-metil-foszfinil)-2-ozi-vajsav (azaz OMPB), amino-donor vegyületek és a transzaminázok vagy transzminázt termelő mikroorga- 10 nizmus sejtek közötti kölcsönhatást a találmány szerinti eljárás szerint folytatjuk le, egy olyan vizes reakcióközeget vagy reakcióelegyet kapunk, amely bizonyos mennyiségű L-2-amino-4-(hidroxi-metilfoszfinil)-vajsavat (azaz L-AMPB) terméket, bizo- 15 nyos mennyiségű maradék el nem reagált OMPB-t, transzaminázt vagy mikroorganizmus sejtet tartalmaz. Mielőtt az említett reakcióoldatból vagy reakcióelegyből az L-AMPB-t kinyerjük, előnyös ha a reakcióelegyet vagy reakcióoldatot lecentrifugál- 20 juk, ha ez mikroorganizmus sejteket tartalmaz, centrifugálással a mikroba sejteket eltávolítjuk a reakcióoldatból vagy reakcióelegyből, és így olyan felülúszó oldatot kapunk, amely az L-AMPB-t tartalmazza, de mikroba sejtektől mentes. 25 Az L-AMPB tennék vizes oldatából történő kinyerését a következőkben ismertetjük. Az LAMPB vizes oldatából történő kinyerését és tisztítását ugyanúgy végezhetjük, mint az olyan ismert módszerekben, akii az L-AMPB-t fermentációs 30 úton állítják elő, és a tenyészetből nyerik ki az L-AMPB-t és tisztítják. Az L-AMPB kinyerését és tisztítását részletesen például a 47485/82 számú közzétett japán szabadalmi bejelentés ismerteti. A találmány szerinti eljárással előállított L- 35 AMPB-t a rcakcióoldatból például úgy nyerhetjük ki, és tisztíthatjuk, hogy az L-AMPB-t tartalmazó reakcióoldatot kationcserélő gyantát, például Dowex 50 W (Rohm and Haas Co. Ltd., USA gyártmány) tartalmazó oszlopon engedjük át, ahol a L- 40 AMPB adszorbeálódik a gyantán, majd az oszlopot vízzel vagy hígított vizes ammóniaoldattal eluáljuk. Az L-AMPB-t tartalmazó eluátum frakciókat összegyűljük, csökkentett nyomáson bepároljuk, 11 7
