200342. lajstromszámú szabadalom • Enzimatikus eljárás L-2-amino-4-(hidroxi-metil-foszfinil)-vajsav előállítására
HU 200342 B XI. táblázat - " 23 24 Teszt sz. Kezdeti OMPB koncentráció (lig/ml) Amino-donor kezdeti kon centrációja a reakció előtt jig/ml) Nátrium L- Nátrium-L -glutamát -aszpartát L-AMPB végső koncentrációja a reakció befejezése után (jjLg/ml) 1. 10000 10000 0 5930 2. 10000 20000 0 7170 3. 10000 0 10000 350 4. 10000 10000 10000 8500 5. 30000 30000 30000 28360 6. 10000 30000 0 8310 7. 10000 100000 0 9470 8. 50000 50000 0 24200 9. 50000 150000 0 35600 10 40000 40000 40000 32590 11. 40000 40000 40000 32840 Megjegyzés: a 9. tesztet 50 *C-on, 9.0 pH-nál, a 11. tesztet Amint a XI. táblázatból látható, az L-AMPB termelése jelentősen emelkedett, amikor aminodonorként nátrium-L-glutamátot és nátrium-L- 25 aszpartátot együtt alkalmaztunk, ahhoz képest, amikor ezeket külön-külőn alkalmaztuk. 13. példa A 12. példa szerinti módon előállított Strep- 30 tomyces hygroscopicus NP-50 törzs tenyészetet oltótenyészetként alkalmaztuk, és a 12. példa szerinti termelő tápközeget tartalmazó 3 literes üvegermentort oltottuk be vele, a tenyésztést 28 *C-on 3 napig folytattuk. 35 21 így kapott tenyészet egy reaktorba vittünk át, amelyhez 300 g OMPB-t adagoltunk. A teayészközeghez hozzáadunk még 310 g nátrium-L-glutamátot (Wako Pure Chemical Industries, Ltd, gyártmány) és 290 g nátrium-L-aszpartátot (Nakarai 40 Chamicals, Ltd. gyártmány). A kapott elegy pH-ját vizes nátrium-hidroxiddal 8,5 értékre állítottuk, és az elegy térfogatát vízzel 10 literre egészítettük ki. így az OMPB koncentrációja 30 000 ^g/ml a reakció kezdetén. A nátrium-L-glutamát és a nátrium- 45 L-aszpartát koncentrációja megegyezik az OMPB moláris koncentrációjával (1/6 mól). Az enzimatikus reakciót enyhe keverés közben 37 ®C-on 24 óra hosszat folytattuk, miközben a pH-t 8,5 értéken tartottuk. A reakció befejezése után a reakcióelegy 50 pH-ját 50%-os kénsavval 3,0 értékre állítottuk. Ezután a sejteket szűréssel eltávolítottuk, így 91 szűrletet kaptunk. A szűrlet L-AMPB-tartalmát a 12. példa szerinti módon határoztuk meg, és 29 000 (jml értéknek 55 találtuk. A szűrletet ezután egy 51-es Dowex 50 W (H+-forma) kationcserélő gyantát tartalmazó oszlopon kromatografáltuk, vízzel eluálva. Az LAMPB-tartalmú frakciókat Dowex 1x2 (CPbCOO'-forma) anioncserélő gyantát tartalma- 60 zó oszlopon kromatografáltuk, amelyet vízzel mostunk, majd 0,3 n vizes ecetsav oldattal eluáltunk. Az L-AMPB-tartalmú frakciókat csökkentett nyomáson szárazra pároltuk, majd vákuumban szárítottuk és így fehér por formájában kaptuk az L- 65 45 °C-on, 8,5 pH-nál végeztük AMPB-t. A fehér port metanolból átkristályosítottuk, így 183 g L-AMPB-t kaptunk (kb. 70%). A kapott L-AMPB-t szokásos módon elemeztük, azaz elemanalízist végeztünk, meghatároztuk az optikai forgatóképességet, olvadáspontot, IR- spektrumot, NMR-spektrumot és tömegspektrumot. Úgy találtuk, hogy a kapott I^AMPB megfelel az autentikus L-AMPB mintáknak. Op = 214 °C (bomlás és habzás közben); [ar°D = 17° (vízben). Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás (I) képletű 2-amino-4-(hidroxi-metilfoszfinil)-vaj sav előállítására, azzal jellemezve, hogy (II) képletű 4-(hidroxi-metil-foszfinil)-2-oxo-vajsavat 6,0 és 9,0 közötti pH-nál, szobahőmérséklet és 60 °C közötti hőmérsékleten amino-donorként alkalmazott L-glutaminsav vagy alkálifémsója, L-aszparaginsav vagy alkálifémsója, L-alanin vagy ammónium-klorid vagy ezek kombinációja jelenlétéinsav-dehidrogenázzal vagy ezek kombinációjával vagy egy vagy több, transzamináz termelésére képes mikroorganizmussal, éspedig Streptomyces, Streptoverticillium, Nocardia, Nocardiopsis, Saccharopolyspora, Micromonospora nemzetségbe tartozó actionyceta, Bacillus, Micrococcus, Staphylococcus, Escherichia, Pseudomonas, Serratia vagy Corynebacterium nemzetségbe tartozó baktérium, Saccharomyces Candida, Cryptococcus, Debaryomyces, Trigonopsis vagy Hansenula nemzetségbe tartozó élesztő, Aspergilus, Mucor, Aureobasidium, Chaetomium, Penicillium vagy Gliocladium nemzetségbe tartozó penésztörzzsel kezelünk, és a (II) képletű vegyületet és az amin-donort 1:10 és 10:1 közötti mólarányban alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1987.06.08.) 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként Streptomyces hygroscopicus SF-1293 (FERM, BP-130) vagy (ATCC 21705), Streptomyces hygroscopicus NP-13
