200334. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 1-[4-hidroxi-3,5-di-(terc-butil)-benzoil ] homopiperazinok és ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
HU 200 patkányon, a toxikusság meghatározása alapján, a vizsgált vegyület 14 napon keresztül történő folyamatos adagolásával történt. 1. Adiuváns artritisz-teszt A vizsgálatokat Pearson módszere szerint [Arthrit. Rheum. 2, 44 (1959)] végeztük. Kísérleti állatként Wistar-Lewis-törzsű, 130-200 g közötti testtömegű him patkányokat alkalmaztunk. A vizsgálandó vegyűleteket 50 mg/kg napi egyszeri adagban, orális úton adtuk be az állatoknak, a kísérlet első napjától az ötödik napig. Egy kontroli-csoport állatai csak a gyógyszerkészítményben alkalmazott vivőanyagot kapták. Mind a kísérleti, mind a kontroli-csoportok 8-8 állatból álltak. A hatás mértékéül a mancs-térfogat százalékos csökkenés szolgált, a hatóanyaggal nem kezelt kontroli-csoport állataihoz viszonyítva. Az alábbi eredményt kaptuk. Példa szerinti Adag Mancs-térfogat vegyület mg/kg p.o. %-os csökkenése az 5. napon 1 2 5 1. 50 25 . 2. 50 34 Afenti adatokból látható, hogy a találmány szerinti hatóanyagok patkányon az adjuvánssal indukált artritiszt szignifikáns mértékben csökkentik. 2. Krónikus cGvH-reakció egéren A Graft-versus-Host-betegség, amely egy a transzplantátumból kiinduló, a gazdaszövet ellen irányuló immunreakción alapul, akut, csaknem mindig halálosan végződő lefolyási alakjában a következő tünetekben mutatkozik: a lép megnagyobbodása, májduzzadás, a limfac somók hipertrófiája, hemolitikus anémia, csökkent immunglobulin- és komplement-tükör, valamint csökkent immun-reaktivitás. A valamivel enyhébb lefolyású krónikus megbetegedési forma limfa-denopáda, immunkomplex-glomerulónefritisz és a szervileg nem specifikus autoantitestek túlságos képződése alakjában jelentkezik. Hasonló kórkép jellemzi a szisztémás lupus erythematodes (SLE) megbetegedést, amely szintén az autoimmunmegbetegedések formakörébe tartozik. A találmány szerinti vegyületeknek a hatását nőstény egereken (DBA/2 x C57B1/6F1 generáció) vizsgáltuk; az állatoknak lép- és thymus-sejtek keverékét adtuk be 2 injekcióban, és vizsgáltuk az fgy kiváltott cGvH-reakció lefolyását az S. Popivic és R. R. Bartlett által leírt kísérleti módszerrel [Agents and Actions 21,284-286 (1987)]; a kísérlet folyamán 7 napi időközzel 5x10' DBA/2 sejtet (nőstény egerekből) adtunk be 0,2 ml kultúra-közegben, intravénás injekció útján. Az így előkészített beteg állatokat az első donorsejt-injekció utáni 21. naptól kezdve 6 hétig kezeltük orális úton a vizsgálandó vegyülettel; a vizsgálandó vegyületet naponta egyszer adtuk be, ugyanakkor a kontroli-csoport állatait csupán az alkalmazott vivőanyaggal kezeltük. Vivőanyagként karboximetil-cellulóz-nátrium-só 100 mg/liter koncentrációjú vizes oldatát alkalmaztuk 10 ml/kg testtömeg adagban. A kísérleti állatcsoportok 10-10 állatból álltak. A kísérletben alkalmazott vegyületek hatását a vizeletbeli fehéije-kiválasztás gátlása és a cGvH-index alapján értékeltük. A beteg állatok a nefronoknak a glomerulák bazális membránjain bekövetkező immunkomplex-lerakódás általi elroncsolása folytán határozott fehérje-kiválasztást mutatnak a vizeletben, amely korrelációban van a glomerulo-nefritiszt mértékével és amely mennyiségileg könnyen követhető a vizeletben kiválasztott fehérjemennyiség meghatározása útján. A másik mérési paraméter, a cGvH-index a cGvH-reakció által kiváltott nagymértékű lépmegnagyobbodásra (splenomegália) vonatkozik. Ezt az indexet a beteg állatok lép- és testtömegének szorzata és a negatív kontrollcsoport kezeletlen állatainál mért megfelelő szorzat hányadosa képezi; az index a betegség súlyosságának megbízható mértékéül szolgál (minél nagyobb az index értéke, annál súlyosabb a betegség). A fent leírt viszgálatoknak az alábbi táblázatban összefoglalteredményeitazt mutatják, hogy az (I) általános képletű vegyületek az autoimmun folyamatokra gyakorolt moduláló befolyásúk útján tartósan csökkenteni képesek cGvH-betegséget Példa szerinti Adag 5-os gátlás vegyület mg/kg/nap fehérje a cGvH-index p.o. vizeletben 6 1. 5 100 57 20 80 75 3. Fordított passzív arthus-reakció patkányon Kísérleti állatként nőstény és hím Sprague-Dawley patkányokat alkalmaztunk, 80 és 100 g közötti testtömeggel. A patkányokat 8-8 állatból álló csoportokba osztottuk be. Az arthus-reakciót 0,1 ml anti-patkány-IgG-oldatnak (0,6 mg/ml) az állatok jobb hátsó mancsába beadott injekcióval váltottuk ki, majd 1 órával az injekció beadása után orális úton adtuk be a vizsgálandó vegyületet, illetőleg a kontroli-csoport állatainak csupán a beadott készítményben alkalmazott vivőanyagot (pozitív kontroll). Az állatok bal mancsába nátrium-klorid-oldatot injektáltunk. Nem szenzibilizált állatok egy csopportját (negatív kontroll) ugyancsak ovalbuminnal kezeltük, hogy kizárjuk a fehérjével szembeni nemspecifikus reakciókat. A vizsgált készítmények hatásának mérésére paraméterként a mancs-térfogat százalékos megváltozását alkalmaztuk, a szenzibilizált, de hatóanyaggal nem kezelt kontrollcsoport állataihoz viszonyítva (pozitív kontroll); a mérést az ovalbumin beadása után 4 órával végeztük, amikor a mancs-duzzadás a maximális értéket elérte. Eredmények Példa szerinfi Fordított passzív arthus-reakció vegyület adag gátlás, % 1. mg/kg p.o. 100 25 2. 20 28 25 37 A toxikusság meghatározása patkányon 10-10 hím és nőstény Wistar-patkányból álló cso port állatait 14 napon keresztül napi 50, illetőleg 7f mg/kg adagban kezeltük orális úton a vizsgálandó készítménnyel, és minden második napon mértük az ál-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
