200257. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rovarpatogén fonálférgek tömegtenyésztésére és biológiai védekezőszerként való alkalmazásukra
3 HU 200257 A 4 infektív lárvákból áll. A hús-zsír alapú tenyésztés jóval termelékenyebb, de bonyolult és költséges előkészítő eljárást (húsfeldolgozás, előfermentálás stb.) igényel, a fonálférgek kinyerése és tisztítása igen nehézkes, a tenyészet (félfolyékony, undort keltő küllemű és szagú massza) közvetlen kijuttatása előnytelen, és nem utolsó sorban említhetjük, hogy ellenőrizhetetlen a kijuttatott fonálférgek száma és azonbelül az infektív lárvák aránya. Jelen találmányunk tárgya olyan, mesterséges közegben végzett tenyésztési eljárás, amely mentes a fent felsorolt hátrányoktól, de egyesíti az ismert eljárások előnyeit. Eljárásunk lényege, hogy a fonálférgek szaporodásához optimális ionkőrnyezetet (pH-t és ozmotikus koncentrációt) biztosító steril sóoldatba steril körülmények között élelmiszer-alapanyagként egyébként is használatos, csiramentes, magas fehérje- és lipidtartalmú adalékot keverünk, az így nyert szuszpenziót megfelelő hordozóközeggel átitatjuk, a kiválasztott fonálféreg faj infektív lárváival beoltjuk és megfelelő hőmérsékleten meghatározott időtartamig tenyésztóegységekben szaporítjuk. Ennek eltelte után a hordozóból a féregtömeget kimossuk, detergens jelenlétében megtisztítjuk a tápközeg maradványaitól és a nem infektív lárva fejlődési alakoktól. A féreg-szuszpenzió sűrűségét megfelelően beállítjuk és a felhasználásig formaldehid-oldatban, hűtve tároljuk. Az optimális ionkörnyezetet biztosító sóoldat pH-ja 4-8 között van, célszerűen 6-7 között. A kémhatás állandóságát bármely, szervetlen vagy szerves vegyületekból ismert módon elkészített puffer-eleggyel biztosíthatjuk. Az oldat összes sókra vonatkoztatott koncentrációja 2,5-25 g/liter. A megfelelő ozmotikus koncentrációt a puffer-elegy vegyületeivel vagy kiegészítésként élettanilag nem káros sókkal, célszerűen nátrium-kloriddal állíthatjuk be. A sóoldat nagy térfogatban készíthető, ismert eljárásokkal (hó, szűrés, stb.) sterilizálható és ilyen állapotban korlátlan ideig tárolható. A magas fehérje- és lipidtartalmú élelmiszeripari alapanyagok közül a vágóhídi defibrinált teljesvér és szérum (bármely állaté), a nyers tojássárgája, a porítva szárítással előállított teljes tojáspor, fehérje- és sárgájapor, a tejpor és tejsűritmények, az állati hús- és hallisztek és egyéb koncentrált húskivonatok (bouillon-por, pepton, húsextraktumok stb.), valamint élesztökészítmények (nedves és száraz élesztő, élesztőkivonatok) alkalmasak. Ezek többnyire csiramentes állapotban kerülnek forgalomba és közvetlenül, de steril körülmények között keverhetők össze a sóoldattal. Alkalmazott koncentrációjuk 0,5-50 g/100 ml (%) lehet, előnyösen 2- -25%. Alkalmazhatók külön-külön, de tetszőleges arányú keverékük is használható. Hordozóközegként alkalmasak a vízben nem oldódó, de hidrofil felületű anyagok, amelyek szivacsos, micellás vagy porózus szerkezetűek, kellően alaktartók (polisztirol vagy más polimer alapú szivacsok és habok, természetes szivacsok, cellulóz alapú rostos szövetek, műszálból készült szövetek és vatták, szervetlen alapú szálas vagy porózus anyagok, mint pl. az üveg- vagy kőzetgyapot, különböző kerámiák, stb.) Előnyösen alkalmazhatók a jó légáteresztő képességű, vékony (2-10 mm) polisztirol szivacslemezek. A felsorolt hordozók fontos előnye még, hogy a tenyészet kitermelése során nem semmisülnek weg, így többszőr felhasználhatók. Tenyésző egységként jól zárható, a szokásos eljárásokkal egészben sterilizálható edényeket alkalmazhatunk. Előnyös, ha az edények alapfelülete nagy. Előnyös, ha zárófedelük kialakítása lehetővé teszi a spontán vagy bármely technikai megoldással elősegített steril levegócserét. A tenyésztés történhet erre a célra kialakított berendezésben (tenyésztőszekrény) is, amelynek belsejében sűrűn elhelyezett tálcákkal igen nagy felület alakítható ki. A tenyésztöszekrény részben vagy egészben automatizált is lehet; műszeres ellenőrzés gondoskodhat a hőmérséklet a páratartalom, gázcsere stb. optimális értékeinek megtartásáról. A tenyésztés első lépéseként elkészített tápoldat (sóoldat + tápanyag) elófermentálhatjuk a tenyészteni kívánt fonálféreg-faj szimbionta baktériumával. A baktériumot fenntarthatjuk tiszta tenyészetben, ügyelve arra, hogy a tenyészet ún. elsődleges (príméi-) fázisú sejtekből álljon, de inokulumot nyerhetünk közvetlenül a baktériumot hordozó infektív lárvákból is, ha azokat steril körülmények között kíméletesen (a baktériumsejteket nem károsító módon) elroncsoljuk (Potter-homogenizátor, késes homogenizátorok, ultrahang stb.). Az előfermentálás történhet rázógépen, keveróberendezésen vagy bármilyen fermentorban ill. aerob baktériumtenyésztő eljárással. Célszerű a tápoldatot elöfermentálni a Neoaplectana-fajok tenyésztéséhez, de ez nem szükséges, sőt hátrányos lehet, ha Heterorhabditis-fajt kívánunk tenyészteni. A tápoldattal ezután bármely módon, de steril körülmények között átitatjuk a hordozóközéget, és az így előkészített tenyésztő egységet a tápoldat mennyiségével arányos, annak milliliterére számított 100- -5000, célszerűen 500-2000 infektív lárvával beoltjuk. A tenyésztés 15-30 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 20-25 °C között, sötétben történik. Időtartama a tenyésztett fonálféreg-faj életciklusától függ, és egyöntetű (szinkron) tenyésztetek esetén célszerűen a harmadik generáció kifejlődéséig tart. Eljárásunk egyik legfontosabb előnye éppen abban áll, hogy az indításhoz (beoltáshoz) alkalmazott infektív lárvákból szinkron tenyészet 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
