200203. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 1,2-dehidro-szteroidok előállítására mikrobiológiai úton
HU 200203 B Infravörös színkép (KBr): vC=01718 (24-es ketyn), vC=0 1661 (3-as keton), vC=C 1624,1603 cm* 'h-NMR spektrum: (CDCla 8): 7,15 (H-l), 63 (H-2), 6,0 (H-4), AMXm (Ji^lOHZ; J2.4=2Hz, Jl,4~0riz), 5,4 m (H-ll), 2,4 s (3H-25), 1,4 s (2H- 19), 0,88 d (3H-21), 0,7 s (3H-18) ppm. Tömegspektrum: Molekulaion: 366. Jellemző ionok (m/z): 366. 351. 349, 225, 212, 173,121,43. 9. példa Mycobacterium lacticola [NCAIM B(P) 000037], illetve Mycobacterium smegmatis [NCAIM B(P) 000038] burgonyás-dextrózos ferdeagaron növesztett 1-2 hetes tenyészeteiről 10-10 ml steril vízzel készített sejtszuszpenziók 1-1 ml-ével 500 ml-es Erlenmeyer lombikokban sterilezett 100-100 ml MFG jelű táptalajt oltunk, melynek összetétele a következő, kukoricalekvár (szárazanyag) 15,0 g glicerin 10,0 g 100 ml csap vízben. A táptalaj pH-ja sterilezés előtt 6,5. A táptalaj sterilezését 121 *C-on, 25 percig végezzük. Az inokulum tenyészeteket 37 'C-on, két napig növesztjük síkrázógépen, majd a tenyészetek 5-5 miével beoltunk 500 ml-es Erlenmeyer lombikokban sterilezett 100-100 ml MKA2 jelű táptalajt, melynek összetétele a következő 13 aszparagin 1,0 g kálium-dihidrogén-foszfát 1.0 g glicerin 5,0 g kukoricalekvár (szárazanyag) 10,0 g az 1. példában megadott nyomelem oldat 1,0 ml 1000 ml csapvízben. A táptalaj pH-ja sterilezés előtt 63. A táptalaj sterilezését 121 *C-on, 25 percig végezzük. A tenyészeteket 37 *C-on, síkrázógépen két napig rázatjuk, majd mindkét lombikba 1,8 g Amberlite XAD-2 adszorpciós gyantát és 13 ml tetrahidrofuránban oldott 100 mg 4,9(1 l)-androsztadién-3,17-diont adagolunk. Ezután a tenyészetek rázatását három napon át folytatjuk, majd a tenyészetben keletkezett 1,4,9( 11 )-androsztatrién-3,17-dion mennyiségét kvantitatív vékonyrétegkromatográfiás módszerrel meghatározzuk. Kifejlesztőszerként n-heptán:etilacetát (4:6) elegyet alkalmazunk. A kromatográfiás elválasztás után a rétegről leoldott termék mennyiségét ultraibolya spektrofotometriás módszerrel állapítjuk meg. A mycobacterium lacticola tenyészetben 65 mg, a Mycobacterium smegmatis tenyészetben 48 mg, l,4,9(ll)-androsztatrién-3,17-dion keletkezett. IQ. példa A Fusarium caucasicum [NCAIM F(P) 00009] burgonyás ferdeagaron növesztett 1-2 hetes tenyészetéről 10 ml steril vízzel készített sejtszuszpenzió 1 ml-ével 500 ml-es Erlenmeyer lombikban sterilezett 100 ml Richard táptalajt oltunk, melynek összetétele a következő: glükóz 50,0 g kálium-dihidrogén-foszfát 0,5 g magnézium-szulfát-víz (1:7) 2,5 g kálium-nitrát 1,0 g ammónium-nitrát 10,0 g 1000 ml csapvízben. A táptalaj pH-ja sterilezés előtt 5,0. Atáptalajt 121 *C-on, 25 percig sterilezzük. Az inokulum tenyészetet 28 ’C-on, egy napig növesztjük síkrázógépen rázatva, majd a tenyészet 5 miével beoltunk 500 ml-es Erlenmeyer lombikban sterilezett 100 ml F-jelű táptalajt, melynek összetétele a következő: glükóz 0,5 g pepton 15,0 g kukoricalekvá (szárazanyag) 6,0 g 1000 ml csap vízben. A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 63-re állítjuk. A táptalaj sterilezését 121 *C-on 25 percig végezzük. A tenyészetet 28 'C-on, síkrázógépeu, egy napig rázatjuk. Ezután a tenyészet 10 ml-ét sterilen 500 mles Erlenmeyer lombikba mérjük, és 90 ml 13 g Amberlite XAD-2 adszorpciós gyantát tartalmazó steril vizet, majd 13 ml tetrahidrofuránban oldott 100 mg 43(ll)-androsztadién-3,17-diont adagolunk hozzá. Két napi rázatás után a tenyészetben 72 mg 1,4,9(11)androsztatrién-3,17-dion-keletkezik a 9. példában leírt vékonyrétegkromatográfiás meghatározás szerint SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás 4,9(ll)-androsztadién-3,17-dion; 3- oxo-23,24-dinor-4,9(ll)-koladién-22-sav és 1-4 szénatomos alkilésztere; 3-oxo-23,24-dinor- 43(11), 17(20)-kolatrién-22-sav és 1-4 szénatomos alkilésztere, 22-hidroxi-2334-dinor-4,9(ll)-koladién-3-on; 27-nor-43(ll)-kolasztadién-3,24-dion, valamint 2637-dinor-4,9(l l)kolesztadién-334-dion 13-helyzetű dehidrogénezésére mikrobiológiai úton, azzal jellemezve, hogy a dehidrogénezést valamely 3- oxo-Al dehidrogenáz aktivitással rendelkező Arthrobacter vagy Mycobacterium nemzetségbe tartozó baktériummal vagy Fusarium nemzetségbe tartozó gombával aerob körülmények között, valamely makropórusos polisztirol típusú abszorpciós gyanta jelenlétében végezik, és a kapott 1,43(1 l)-androsztadién-3,17-diont; 3-oxo-2334-dinor-l,4,9(ll)-koladién- 22-savat és 1-4 szénatomos alkilészterét; 3-oxo- 2334-dinor-1,4,9(11), 17(20)-kolatrién-22-savat és 1-4 szénatomos alkilésztere, 22-hidroxi-23,24-dinor-1,43(1 l)-koladién-3-ont; 27-nor-l,4,9(1 l>kolasztadién-334-diont, vagy 2637-dinor-1,4,9( 1 l)kolesztadién-334-diont kívánt esetben a fermentléből elkülönítjük. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a mikrobiológiai átalakítást Arthrobacter simplex [NCAIM B(P) 000066] tenyészettel végezzük. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a mikrobiológiai átalakítást Mycobacterium lacticola [NCAIM B(P) 000037] tenyészettel végezzük. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a mikrobiológiai átalakítást Microbacterium smegmatis [NCAIM B(P) 000038] tenyészettel végezzük. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a mikrobiológiai átalakítást Fusarium caucasicum [NCAIM B(F) 000090] tenyészettel végez-14 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
