200194. lajstromszámú szabadalom • Eljárás pertussis endotoxin eltávolítására
HU 200 A találmány tárgya eljárás pertussis endotoxin eltávolítására és endotoxinmentes pertassis toxoid előállítására. A pertussis a Bordetella pertussis által okozott csecsemők és kisgyermekek körében súlyos lefolyású fertőző betegség. A betegség megelőzésére vakcinát alkalmaznak. Az olyan vakcinák azonban, amelyeket a teljes B. pertussis sejt felhasználásával készítenek, erős mellékhatásokat, például lázat okoznak. A mellékhatások kiküszöbölése céljából sejtmentes pertussis vakcinát (ACP vakcina) fejlesztettek ki, amely lényegében véve endotoxin (ET) mentes. Az endotoxin felelős a lázért és egyéb mellékreakciókért. Az endotoxinmentes vakcinát úgy készítik, hogy elválasztják a fertőzésellenes frakciót (a továbbiakban a helyenként védőfrakciónak nevezzük), úgymint a rostos hemaglutinint (FHA), a pertussis toxint (PT) és a rostokat Az ACP vakcina előállításának legfontosabb lépése az endotoxin elválasztása a fertőzésellenes frakciótól, amelyet rendszerint szacharóz-gradiens centrifugálással végeznek (57-50925. sz. közzétett japán szabadalmi leírás, amely megfelel a 47802. sz. közzétett európai szabadalmi leírásnak). Ezenkívül ismeretes, hogy a pirogén anyagok elválasztására kalcium-foszfát-géles módszert alkalmaznak (34-2549. sz. közzétett japán szabadalmi leírás). Ismeretes továbbá, hogy a hidroxil-apatit-gél, a kalcium-foszfát-gél stabilizált formája, alkalmas a rostos hemagluünin elválasztására a pertussis toxintól, továbbá, hogy az endotoxin-mentes hemaglutinin elválasztható a pertussis toxintól hidroxil-apatit-gélen végzett kromatográfiával, majd affinítás-kromatográfiával végzett tisztítással és a szacharóz-gradiens centrifugál ássál. (Japanese Journal of Bacteriology, 2S 0). 423, 1983). Az önmagánban végzett szacharóz gradiens centrifugálás az endotoxinnak körülbelül 99,995%-a eltávolítására alkalmas, de mivel a nyers, fertőzésellenes frakciót tartalmazó folyadék endotoxinban gazdag, nehéz elérni a védőfrakció teljes megtisztítását az endotoxin tói, és ennek megfelelően a védőfrakció kihozatala nem elég magas. Továbbá mivel a termelő térfogat kicsi és nagy a költség és időráfordítás, a módszer nem megfelelő kereskedelmi mennyiségű oltóanyag előállítására. Másrészt a csupán kalcium-foszfát-géllel végzett kezelés az endotoxinnak körülbelül csak 90-99,9%a eltávob'tását biztosítja, így nem megfelelő gyakorlati célokra. Laboratóriumi körülmények között a rostos hemaglutinin eléggé endotoxinmentesen elválasztható és megtisztítható a pertussis toxintól történő elválasztás során, ha hidroxil-apatit- oszlopkromatográfiával, affinitás kromatográfiával és szacharóz-gradiens centrifugálással kombináljuk, a módszer azonban kereskedelmi mennyiségű oltóanyagtermelésre nem alkalmazható. Kísérleteink során úgy találtuk, hogy a szacharóz gradiens centrifugálást megelőzően kalcium-foszfátgélt képzünk a folyadékban, a védőfrakció nagyon élesen elválasztható az endotoxintól, és emellett javul a térfogatkihozatal és jelentősen javul az endotoxin elválasztásának aránya az önmagában végzett szacharóz sűrűség centrifugáláshoz képest A találmány tárgya tehát egyrészt eljárás endoto-1 xin eltávolítására Bordetella pertussis I fázisú törzs endotoxinját és fertőzés elleni frakcióját tartalmazó folyadékból zónacentrifugálással oly módon, hogy a zónacentrifugálás előtt a folyadékban fokozatosan 4 *C és szobahőmérséklet közötti hőmérsékleten, 6,5 és 9 közötti pH-értéken 0,01-1 milliekv/ml kalciumfoszfát-gél csapadékot képezünk a foszfátionok ekvivalenseinek 1,25-30-szoros fölöslegével a kalciumionok ekvivalenseire számítva, és a kapott csapadékot elkülönítjük, másrészt eljárás pertussis toxoid előállítására oly módon, hogy a fenti módon kapott fertőzés elleni frakciót tartalmazó folyadékot toxinmentesítjük, és olyan pertussis toxoidot nyerünk, amelynek endotoxin tartalma 10 pg protein-nitrogénra vonatkoztatva kevesebb, mint 0,5 ng. A pertussis endotoxin eltávolítása a találmány szerinti módon lehetővé teszi, hogy a fertőzés ellenes frakciót biztosabban és élesebben válasszuk el az endotoxintól úgy, hogy a védőfrakció könnyebben és jobb kihozatallal nyerhető. Ezenkívül, mivel a zónacentrifugálással nagy térfogatú kiinduló anyag dolgozható fel, a pertussis toxoid kinyerése megduplázható hatékony endotoxin eltávolítás mellett. így a találmány ipari szempontból is értékes. Azonkívül a találmány szerinti eljárással kapott pertussis toxoid endotoxin tartalma kevesebb, mint tizedrésze a jelenleg forgalomban levő toxoidokénak, így a találmány szerinti eljárással előállított pertussis toxoid alkalmas olyan vakcinák előállítására, amelyeknek immunológiai hatékonysága azonos az ismert vakcinákéval, toxieitása azonban kisebb. Az említett, Bordetella pertussis I fázisú törzs fertőzésellenes frakcióját és endotoxinját tartalmazó folyadék például a B. pertussis I fázisú törzs tenyésztésével kapott tenyészközeg vagy ennek koncentrátuma lehet, a koncentrátum különösen előnyös. A Bordetella pertussis I fázisú törzs tenyésztése a szokásos módon történhet így például a mikroorganizmust tenyészközegen (például Cohen-Wheeler vagy Stainer- Scholte közegen) körülbelül 35-37 *C-on, körülbelül 5-7 napig tenyésztjük. Az így kapott fermendé felülúszóját például szűréssel vagy centrifugálással összegyűjtjük. A felülúszőt közveüenül vagy betöményítés után alkalmazhatjuk a következő lépésben az endotoxin eltávolítására. A betöményítést az ismert kisózási módszerrel végezhetjük. Például eljárhatunk úgy, hogy 2-5 kg ammónium-szulfátot adagolunk, minden 101 fermendé felülúszójához, és a kapott csapadékot például szűréssel vagy centrifugálással elválasztjuk. A csapadékot alkalmas mennyiségű 1 mól/1 nátrium-klorid - 0,05 mól/1 foszfát-pufferben feloldjuk, és az oldatot centrifugáljuk, vagy más módon elválasztjuk a felülúszőt A találmány szerinti eljárással az endotoxin elválasztását úgy végezzük, hogy a Bordetella pertussis I fázisú törzs fertőzés elleni frakcióját és endotoxinját tartalmazó folyadékban fölösleges mennyiségű foszfátion jelenlétében kalcium-foszfát-gél csapadékot képezünk, a kapott csakadékot elkülönítjük, és a folyadékfázist zónaccntrifugálásnak vetjük alá. Ha a folyadékban foszfátion nincs jelen, akkor a folyadékhoz foszfátpuffert, például 1 mól/1 nátriumkloriddal kiegészített 0,05 mól/l-es foszfát-puffért adunk, majd kalciumionnal egészítjük ki. Kalciumion-fonásként bármely oldható kalciumsót alkalmaz2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
