200101. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán szövet plazminogén aktivátort tartalmazó stabilizált gyógyszerkészítmények előállítására
7 Hü 200101 B 8 Készítmény: 1. 1,355 mg/ml t-PA 0,05 mól nátrium-foszfát pH 6,2 0,05 mól arginin-hidi-oklorid 2. 0,498 mg/ml t-PA 0,03 mól nátrium-foszfát pH 6,2 0,2 mól arginin-hidroklorid A fenti összetételű készítmények 0,5 ml-es alikvot mintáit aszeptikus körülmények között 2 ml-es üveg ampullákba töltöttük, melyeket lezártunk. Az ampullákat 25 °C-on, 37 °C-on és 45 °C-on tartottuk. Minden oldatból két-két ampullából mintát vettünk a 0., 20., 55. és 160. napon, és a t-PA aktivi- 5 tást az S-2288 módszerrel vizsgáltuk. A fennmaradó %-os aktivitás természetes logaritmusát feltüntettük az idő függvényében (napok) minden egyes hőmérsékleten, majd kiszámoltuk a sebességi állandót a lineáris 10 regressziós analízis alkalmazásával. A t-PA stabilitás csökkenésének sebességi állandóját (k) két különböző arginin-koncentráció esetében és különböző hőmérsékleteken a 2. táblázatban tüntetjük fel. 2. táblázat Az arginin hatása a t-PA stabilitására Készítmény Arginin 25 °C k (nap-1) 37 °C 45 °C 0,05 mól Na-foszfát pH 6,2 0,03 mól 0,05 mól 0,00137 0,0102 0,0167 Na-foszfát pH 6,2 0,20 mól 0,00043 0,00569 0,01272 Mint látható, 0,2 mól arginin olyan se-30 sékleten. Az eredményeket a 3. táblázatban bességi állandót eredményez, amely kisebb, adjuk meg. mint a 0,05 mól arginin esetében kapott, mindegyik vizsgált hőmérsékleten, ami azt mutatja, hogy az arginin-koncentráció nőve- 3. táblázat kedése növeli a t-PA stabilitását. 35 A Polysorbate 80 hatása a t-PA stabilitására 3. példa A t-PA stabilitása a nem-ionos felületak- 40 tiv anyagok koncentrációjának is függvénye. A megfelelő adatokat a 3. táblázat tartalmazza. A t-PA-t 0,01 mólos Na-szukcinót pufferrel, pH 6,0-on végzett dialízissel csaptuk 45 ki. A t-PA precipitátumot centrifugálással gyűjtöttük össze a dializált mintából. Ezt a csapadékot újból feloldottuk az alábbi készítményben, amely változó koncentrációban tartalmazta a polysorbate 80-at. 50 Készítmény: 0,2 mól arginin-hidroklorid 0,02 mól nátrium-foszfát pH 7,2 Polysorbate 80 (0,0005-0,10 X) 55 Az oldatokat aszeptikus körülmények között ampullákba töltöttük, és 35 °C-on illetve 40 °C-on tartottuk. Minden időpontban két-két kémcsőből mintát vettünk, és az enzimatikus aktivitást az S-2288 vizsgálattal 60 vizsgáltuk. A sebességi állandókat a 10 g (t-PA aktivitás) lineáris regressziós analízisével számoltuk az idő függvényében minden hómér-Polysorbate 80 k 35°C (nap*1) 40°C 0,0005 0,0055 0,0106 0,05 0,0049 0,0091 0,01 0,0043 0,0088 0,025 0,0040 0,0081 0,05 0,0041 0,0077 0,10 0,0037 0,0075 A táblázat adatai azt mutatják, hogy amint a polysorbate 80 koncentrációja nő, a sebességi állandó (k) csökken. Ezt az jelzi, hogy több polysorbate 80 jobb stabilitást biztosít. 4. példa Tisztított t-PA-t az alábbi argininium-foszfát puffer készítménnyel szemben dializálva t-PA oldatokat készítettünk, amelyeket további pufferrel a kívánt végső t-PA koncentrációra hígítottunk. 6 X.
