200101. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán szövet plazminogén aktivátort tartalmazó stabilizált gyógyszerkészítmények előállítására
3 HU 200101 B 4 megfelelői. A nem megfelelő ellenionok közül példaképpen a klorid iont említjük meg. Mint már említettük, a feltalálók azt találták, hogy az arginin (argininium ionként történő) beépítése t-PA-t tartalmazó gyógyszerkészítményekbe jelentősen növeli a t-PA oldhatóságát és stabilitásét ezekben a készítményekben. Az arginin-koncentrációk körülbelül 0,02 mól és 1 mól, előnyösen körülbelül 0,05 - 1,0 mól, még előnyösebben körülbelül 0,1 mól és 0,5 mól között változnak az adagolásra használt oldatban és/vagy a liofilizált vagy liofilizélés előtti oldatokban. Ezen felül a javitott készítmények adott esetben tartalmazhatnak még egy vagy több nem-ionos detergenst, igy polysorbate 20-t vagy polysorbate 80-at vagy hasonlókat, körülbelül 0,001 - 1 X mennyiségben, a t-PA stabilitásának további javítása érdekében. Ezenkívül egyéb, gyógyászatilag elfogadható, szakember számára jól ismert vivőanyagok is részei lehetnek a készítményeknek. Ezek közé tartozhatnak például különböző töltőanyagok, további pufferek, kelatáló szerek, antioxidánsok, tartósítószerek, társoldószerek és hasonlók, amelyek közül példaképpen a következőket említjük: mannitol, trometarain sók (.Tris puffer"), dinátrium-edetát, zselatin, humán szérum albumin vagy más polipeptidek, különböző oligopeptidek, így glicil-glicin. A találmány szerinti t-PA készítményekben meglepő módon nincs szükség nagy koncentrációjú, azaz 0,3 mól vagy e feletti natrium-klorid alkalmazására. Sőt, a klorid ion nagy koncentrációban való jelenléte hátrányosan befolyásolja a javított készítmények liofilizálhatóságát. Bár bizonyos mennyiségű klorid ion jelenléte megengedhető, előnyben részesítjük a kis, azaz körülbelül 0,3 mólnál kisebb és előnyösen a normál fiziológiai szintet, azaz körülbelül 0,12 mólt meg nem haladó nátrium-klorid koncentrációkat. Legelőnyösebben a találmány szerinti készítmények egyáltalán nem tartalmaznak klorid iont. A t-PA .gyógyászatilag hatásos mennyisége" kifejezést olyan mennyiség jelölésére alkalmazzuk, amely különböző adagolási tartományokban gyógyhatást eredményez. A készítmények ennek megfelelően körülbelül legalább 0,1 mg/ml-tól egészen körülbelül 50 rag/ml t-PA-t tartalmazó formákban kerülhetnek kiszerelésre. Az előnyös t-PA koncentráció körülbelül 0,4 mg/ml és 5 mg/ml között van. Ha a készítményeket például miokardiális infarktusban szenvedő humán pácienseknek kívánjuk adagolni, ezek körülbelül 0,4 mg/ml és 3 mg/ml közötti t-PA mennyiséget tartalmazhatnak, az ilyen kezelések esetében jelenleg alkalmazott dózis értékének megfelelően. A találmány szerinti készítmények kiterjednek a liofilizált formákra. A készítmények előállítása a komponensekből általánosan ismert gyógyszerkészítmény előállítási eljárásokkal, önmagukban ismert módon történik. Hasonlóképpen, standard liofilizálási eljárásokat és az irodalomból jól ismert liofilizáló berendezéseket alkalmazunk. A találmány szerinti gyógyszerkészítmények előállítására alkalmazott egyik konkrét eljárás során (a standard protein-tisztítási rendszerben) a számos ismert puffer cserélő eljárás egyikével, például gél szűréssel tisztított t-PA-t alkalmazunk. Ezt az előnyös eljárást használtuk a következő stabilitási és oldhatósági vizsgálatokhoz felhasznált t-PA izolálására és tisztítására. Az előnyös módszer alkalmazása során felhasznált t-PA-t rekombináns úton módosított Chinese Hamster Ovary (CHO) sejtekből állítottuk elő, amelyek a CHO sejt tenyészet táptalaján képesek a t-PA kiválasztott termékként történő termelésére. Felismertük azt a meglepő jelenséget, hogy a t-PA-t tartalmazó gyógyszerkészítmények szignifikánsan stabilabb biológiai hatást mutatnak, ha egyik komponensük argininium iont tartalmazó puffer, és az ilyen készítményekben nem szükséges a nátrium-klorid jelenléte a stabilitás biztosításához, bár 0,3 mól alatt só-koncentráció megengedett. Egy előnyös megvalósítási mód esetében a klorid ion koncentráció 0,1 mól vagy ennél kevesebb. A természetes pH-tartományban, azaz körülbelül pH 6 és 8 között a t-PA oldhatósága úgy megnő az argininium ion jelenlétében, hogy viszonylag magas koncentrációjú készítmények állíthatók elő belőle, az irodalomban eddig erre a célra egyértelműen megkívánt nagy mennyiségű stabilizáló só jelenléte nélkül is. A találmány ismertetésében használt .humán szövet plazminogén aktivátor", .humán t-PA" vagy .t-PA" kifejezések humán extrinsic (szövet-típusú) plazminogén aktíváiért jelölnek, amelynek előállítása például természetes forrásból extrakcióval és tisztítással (lásd Collen és munkatársai korábban idézett közleményét) történik, és rekombináns szövet tenyésztési rendszerekben, az itt ismertetett módon. Szekvenciája és jellemzői szerepelnek például a 93619 számon, 1983. november 9-én publikált európai szabadalmi bejelentésben, melynek elsőbbsége 1982. május 5. Lásd még a 41766 számon, 1981. december 16-án közrebocsátott, 1980. június 11—i elsőbbségű európai szabadalmi bejelentést és Rijken és munkatársai, Journal of Bioi. Chem., 7035 (1981) közleményét. A kifejezések hasonlóképpen a biológiailag aktív humán szövet plazminogén aktivátor ekvivalenseket is felölelik, amelyek egy vagy több aminosavban különböznek az általános szekvenciától, vagy a glikozilezés mértékében. Ezek a tulajdonságok függnek az alkalmazott, konkrét tenyésztési körülményektől, és attól a gazdától, amelyből a szövet plazminogén aktivátort kinyerjük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
