200093. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tumorellemes gyógyászati készítmények előállítására
25 HU 200093 B 26 képest kevesebb volt. Ezzel szemben észlelhető a sejtmembrán aktiv tevékenységére utaló mikrobolyhok kialakulásai valamint a citoplazmában elektrodenz testecskék megjelenése, amelyek katekolamin szemcséknek felelnek meg. A biokémiai vizsgálatok a DOPA dekarboxiláz enzimaktivitás érték kifejezett növekedését mutatták, a kontrolihoz képest 65- -70%-os növekedés volt észlelhető. A vizsgált rendszerekben CDM kezelés mind az embrionális hipotalamusz, mind az N18-as sejttenyészetek esetében 10 jumol/1 koncentrációban és 24 órás inkubációs idő során fejtette ki a maximális hatást a differenciálódásra. 3.) Humán embrionális fibroblaszt szóvettenyászet Normál humán embrionális fibroblaszt sejtvonalon vizsgáltuk a különböző inkubációs idejű és koncentrációjú CDM morfológiai hatását. Módszerek Transzmissziós eletktronmikroszkópos (TEM) rutin vizsgálat, speciális .orientált’ metszési technikával (metszés a vizsgált szubsztrátum síkjára merőlegesen), valamint scanning elektronmikroszkópos vizsgálat. Egy és 20 órás inkubálási időt alkalmazva, a CDM koncentrációja 6,6-16 jumol/1 volt. Eredmények A legkifejezettebb morfológiai változásokat 20 órás inkubáció után 16 jumol/1 CDM koncentráció jelenlétében észleltük. A scanning elektronmikroszkópos vizsgálatok eredménye:- az osztódás szakaszában levő .single sejtek* esetében jelentős sejtnyúlvány-képződés látható, valamint a nyúlványok széli része elsimult .rafflingok’ hiánya, melyek szubsztrát adhézióra a sejtek erőteljes rögzítettségére utalnak.- A sejtek közötti határok elmosódottakká válnak a sejtfelszin felett, mely a sejtek által termelt sejtközötti állomány fokozottabb termelésére utal. A transzmissziós elektromikroszkópos vizsgálatok eredménye:- a durva endoplazmatikus retikulum vezikulái kitágulnak;- erőteljes citoplazmatikus vakuolizáció jelentkezik. 4.) A CDM hatása MC29/L avian myelocitomatosis vírussal transzformált fürjblaszt sejtvonalra A citoszkeleton aktin filamentumainak változása: A magasabbrendú sejtek váza a citoszkeleton, amely a sejtek citoplazmájában levő fehérje fonalak komplex hálózata. Fő alkotó elemeik az actin-filamentumok, ezek jelenlétét, illetve változásait vizsgáltuk normális és daganatvirussal transzformált, illetve CDM-mel kezelt fibroblaszt sejtekben. A normális fibroblasztokban erőteljes, rendezett kötegeket alkotó, a citoplazma teljes egészére kiterjedő határozott aktin kötegeket figyelhetünk meg. A daganatvirussal transzformált sejtek egész morfológiai megjelenése különbözik a normálistól. Bennük az aktin filamentumok felrostozódnak, csomókban, rendszertelenül, irányultság nélkül helyezkednek el, a citoplazma egy részén találhatók, vagy sok helyen nem is ismerhetők fel. Módszer: Immunfluoreszcencia: a sejtek vázát - a citoszkeletont - felépítő actin filamentumok épségét, illetve megváltozását a normális, a transzformált és a CDM-mel kezelt sejtekben indirekt immunfluoreszcenciával mutattuk ki. A sejteket vékony, kör alakú fedölemezre növesztettük, majd anti-aktin nyúlszérummal inkubáltuk 37 °C-on, 40 percig. Alapos mosás után a minták egy részét második antitestként fluoreszceinnel, más részét rodaminnal konjugált anti-nyúl kecskeszérummal inkubáltuk az előzőekhez hasonló módon. A második antitest konjugáció után a mintákat fluoreszcens mikroszkóppal ultraibolya fényben vizsgáltuk. Eredmény: A CDM kezelés után a sejtek ismét határozott morfológiai megjelenésűek, nyúlványokkal rendelkeznek, és a korábban csomókká töredezett aktin részecskék fílamentumokká rendeződnek. Ezek irányultsága azonban még nem olyan erőteljes, mint a normális sejtekben. Lényegében hasonló folyamat figyelhető meg, ha fluoreszcein helyett rodaminnal festettük meg a citoszkeleton filamenturaait a teljesebb demonstrálhatóság kedvéért. A vizsgálatok azt mutatják, hogy a CDM a virus által transzformált sejtek citoszkeletális rendszerét reorganizálja. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 15
