199899. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A 80577 jelű poliéter antibiotikum és ezt tartalmazó takarmány-kompozició előállítására
1 HU 199899 B 2 alábbi. Alkotórész______________ Mennyisén (g/l) Glükóz 25,0 Melasz 15,0 Élesztőkivonat 5,0 Enzimmel hirolizált kazein’ 3,0 MgSC)4 (vízmentes) 1,0 CaCO, 2,0 Csapvíz 1 literre *N-Z Amine A Az inokuláll termelő tápközeget 250 ml-es szélesszájú Erlenmeyer lombikban inkubáljuk 30 °C hőmérsékleten 8 — 10 napon át olyan rázógépen, amely 5,08 cm-es körben tér ki, 250 fordulat/perccel. B. Actinomadura verrucosospora fermentoros fermentációja Abból a célból, hogy nagy térfogatú inokulumhoz jussunk, 10 ml inkubált első stádiumú tápközeget, amelyet az A részben leírtak szerint készítettünk el, alkalmazunk 400 ml második stádiumú növesztő tápközeg beoltására, amelynek ugyanaz az összetétele, mint az első stádiumú tápközegé, azt a második stádiumú vegetatív tápközegei két literes, széles szájú Erlenmeyer lombikban inkubáljuk mintegy 48 órán át 30 °C hőmérsékleten olyan rázógépen, amely 5,08 cmes körben tér ki, 250 fordulat/perccel. Az így készített, inkubált második stádiumú vegetatív tápközeget (400 ml) alkalmazzuk 101 1 steril termelő tápközeg inokulálására; ezt a tápközeget úgy készítjük, amint ezt az A részben leírtuk, azzal a kivétellel, hogy P-2000 (0,1 ml/1) és Sag 471 (0,2 g/1) habgátló szereket is adunk hozzá. Az inokulált termelő tápközeget hagyjuk fermentálódni 165 literes kevert fermentorban 4 — 5 napon át 30 °C hőmérsékleten. A levegőáramlást (0,5-0,6 térfogat/térfogat/m) a kevert (200 - 250 fordulat/perc) tartályban úgy állítjuk be, hogy az oldott oxigén szintje a 30%-os levegő telítettség fölött maradjon. 2. példa A80577-nátrium-s6 izolálása Kél 100 literes fermentációból származó egyesített fermentációs tenyészlevet (187 liter) szűrünk 3% Hyflo Supercel segítségével. A miceliális szűrőpogácsát kétszer extraháljuk 40 liter acetonnal. Az acetonos extraktumokat egyesítjük és vákuumban koncentráljuk, hogy az acelont eltávolítsuk. A konicntrátumot (20 liter) egyesítjük a tenyészlé szűrlettel (162 liter), az oldat pH-ját 9.0-re állítjuk be 50% NaOH-val, és extraháljuk 125 liter etil-acetáltal. Az etil-acelátos extraklumot vákuumban koncentráljuk olyan maradékig, amely 5 °C hőmérsékleten álláskor kikristályosodik. A kristályokat egymás után mossuk pentánnal, acetonitrillel, és dietil-éterrel, és vákuumban szárítjuk. 36,4 gramm fehér, kristályos A80577-nátrium-sót (op. 275 — 278 ’C) kapunk kitermelésként. A kristályokat álkristályosítjuk olyan módon, hogy 1,0 g-ot feloldunk 100 ml acetonban, hozzáadunk 100 ml HiO-t, és állni hagyjuk 5 °C hőmérsékleten 72 órán át, hogy kristályosodjék. A kristályosodást további 100 ml víz.aceton (3:1) hozzáadásával tesszük teljessé. A kristályokat kiszűrjük és szárítjuk; kitermelés 788 mg (op.: 276- 278 °C). Az A80577-nátrium-só további kinyerését a fenti egyesített mosófolyadékokból és anyalúgokból úgy érjük el, hogy az oldatot szárazra koncentráljuk, feloldjuk 250 ml toluolban és toluollal készített 2 1 szilikagélt (Grace Grade 62) tartalmazó oszlopra visszük fel. Az oszlopot 10 1 toluollal mossuk, majd kifejlesztjük egymás után 10 1 toluoketanollal (98:2) és 10 1 toluolxtanollal (96:4), 1 literes frakciókat gyűjtve. Az eluálást TLC és biológiai mérés követi, Bacillus subtilist alkalmazva. A 13—18. frakciókat, amelyek az A80577-et tartalmazzák, egyesítjük és vákuumban koncentráljuk, a kapott maradékot dietiléterrel mossuk és szárítjuk, így kitermelésként 2,3 g amorf A80577-Na-t kapunk. 3. példa A80577 szabad sav előállítása A80577 nátrium sót (lg) feloldunk 100 ml acetonban és 0,1 n HCl-t (100 ml) adunk hozzá. Az oldatot 15 percig kevertetjük. Az oldatot kétszer extraháljuk 100-100 ml etil-acetáttal. Az etil-acetátos extraktumokat egyesítjük és vákuumban koncentráljuk olajos maradékig. A maradékot 50 ml dioxánban eloldjuk és fagyasztva szárítjuk, így kitermelésként 0,9 g A80577 savat kapunk. A terméket nátrium-sójaként azonosítjuk (az azonosítási adatok megfelelnek a leírás első részében közölteknek). 4, példa A80557 kálium só előállítása 100 mg sav formájú A80577-et feloldunk 20 ml tetrahidrofuránban. 3 ml vizet és 6 mi 2 n KOH-t adunk hozzá és a keveréket 15 percen át kevertetjük. 30 ml vizet adunk hozzá és az oldatot kétszer extraháljuk 60 — 60 ml dietil-éterrel. Az egyesített extraktumokat dioxánban feloldjuk, és fagyasztva szárítjuk, így kitermelésként 100 mg A80577-et kapunk kálium-só formájában (op.: 270-272 °C). SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás az (1) képletû A80577 antibiotikum és bázisos sói előállítására, azzal jellemeze, hogy az Actinomadura verrucosospora NRRL 18236 törzset, vagy ennek valamely A80577-termelő variánsát vagy mutánsát asszimilálható szén-, nitrogén-forrást és szervetlen sókat tartalmazó tenyésztő tápközegben süllyesztett, aerob fermentációs körülmények közt tenyésztünk, majd kívánt esetben a kapott antibiotikumot bázisos sóvá alakítjuk, és kívánt esetben a kapott antibiotikumot vagy bázisos sóját a tenyésztő közegből elkülönítjük. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az A80577 antibiotikumot a tenyésztő tápközegből elkülönítjük. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás azzal 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
