199899. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A 80577 jelű poliéter antibiotikum és ezt tartalmazó takarmány-kompozició előállítására
t HU 199899 B 2 A szervetlen só tápanyagok között, amelyeket előnyösen be kell építeni a tenyésztő tápközegbe, vannak a szokásos oldható sók, amelyek képesek cink, nátrium, magnézium, kalcium, ammónium, klorid, karbonát, szulfát, nitrát és hasonló ionokat szolgáltatni. Az organizmus növekedéséhez és fejlődéséhez szükséges esszenciális nyomelemek szintén kell, hogy legyenek a tenyészközegben. Az ilyen nyomelemek általában szennyezések formájában előfordulnak a lápközeg többi alkotórészeiben olyan mennyiségben, amely elegendő az organizmus növekedési szükségleteinek kielégítésére. Ha a habzás gondot jelent, kis mennyiségű habgátló szert, pl. polipropilénglikolt adhatunk a nagyléptékű fermentációhoz. Az A80577 antibiotikum nagyobb mennyiségeinek termeléséhez süllyesztett aerób fermentáció szükséges fermentorokban. Kis mennyiségű A80577-ei kaphatunk rázott lombikos tenyésztéssel is. Mivel az antibiotikum termelésében általában a nagy fermentoroknak az organizmus spóra formájában végzett inokulálásánál hosszú a "log' fázis, előnyös vegetatív inokulumot alkalmazni. A vegetatív inokulumot úgy készítjük, hogy tenyésztő tápközeg kis térfogatát inokuláljuk az organizmus spóra-formájával vagy miceliális fragmentumaival, hogy az organizmus friss, aktívan növekvő tenyészetét megkapjuk. A vegetatív inokulumot azután nagyobb fermentorba visszük. A vegetatív inokulum tápközege lehet azonos, mint amelyet a nagyobb fermentációknál alkalmazunk, de más tápközeg is lehet megfelelő. Az A8l)577-et az Actinomadura verrucosospora mintegy 25 °C és 37 °C hőmérséklet között termeli. Az optimális hőmérséklet az A80577 termeléséhez mintegy 30 °C. Amint ez szokásos a süllyesztett aerób tenyésztési eljárásokban, steril levegőt fúvatunk át a tartályon a fenékről, miközben a tápközeget hagyományos turbina lapátkerékkel kevertetjük. A levegőztetési sebességnek és a keverési sebességnek általában olyannak kell lennie, hogy elegendő legyen az oldott oxigén szintet 30% telítettség fölött tartani. Az A80577 antibiotikum termelését a fermentáció során a tenyészlé mintáinak vizsgálatával követhetjük antibiotikum-aktivitásra olyan organizmusok ellen, amelyekről ismert, hogy az antibiotikumra érzékenyek. Az egyik teszt organizmus, amely alkalmas az A80577 vizsgálatára, a Bacillus subtilis ATCC 6633. A biológiai vizsgálatot kényelmesen az agar-üreg lemez vizsgálattal végezzük el. A süllyesztett aerób fermentáció körülményei közölt végzett termelését követően az A80577-et kinyerjük a fermentációs tápközegből olyan módszereket alkalmazva, amelyek ismertek a fermentációs szakterületen. Az A80577-termelő organizmus fermentációja során termelt antibiotikum aktivitás előfordul mind a micéliumban, mind a tenyészlében. Az A80577 maximális kinyerését végrehajthatjuk ennél fogva úgy, hogy először a közeget szűrjük, hogy a tenyészlevet a micélium-tömegtől elkülönítsük. A szűrt tenyészlevet és a micélium-tömeget azután különkülön tisztítjuk, hogy megkapjuk megfelelő A80577 részüket. Sokféle technika alkalmazható ennél a tisztításnál. A szűrt tenyészlé tisztításához egyik előnyös technika magában foglalja a beállítást mintegy pH 9 értékre, és az extrahálást megfelelő oldószerrel, pl. etil-aceláttal. Az extraháló oldószert azután bepárolhatjuk vákuumban, hogy megkapjuk az A80577 tenyészlének megfelelő részét. A micélium-tömeg tisztításának előnyös módszere, hogy extraháljuk az elkülönített micélium szűrőpogácsát megfelelő oldószerrel, pl. acetonnal. Az extraháló oldószert azután vákuumban bepároljuk, hogy koncentrált vizes oldatot kapjunk. Ezt a vizes oldatot azután mintegy pH 9-re állítjuk be és megfelelő oldószerrel, pl. etil-acetátta), extraháljuk. Az extraháló oldószert azután vákuumban koncentráljuk, hogy megkapjuk az A80577 mieéliumnak megfelelő részét. Az A80577 komplex tenyészlé és micélium részeit tovább tisztíthatjuk hasonló eljárásokkal. Az egyik előnyös módszer magában foglalja a szilikagél kromatográfiát. Az A80577 antibiotikum elkülönítését vékonyrélegkromatográfiával (TLC) vagy nagyteljesítményű folyadékkromatográfiával (HPLC) követhetjük. Kényelmes szilikagél TLC oldószerrendszerek az etil-acetát; etil-acetát:acetonitribammónium-hidroxid; és toluokacetonitril: :ecetsav. Előnyös szilikagél oldószer rendszerek az etil-acetát: etil-acetát:acetonitril:ammónia (90:9:1); és loluol:acetonitril:ecetsav (40:59:1). Poliamid lemezek szintén kényelmesen alkalmazhatók aceton:víz:ammónia oldószer rendszerben, előnyösen 30:69:1 arányban. Az antibiotikumot bioautográfíával lehet kimutatni, pl. Vacillus subtilist alkalmazva, vagy más módszerekkel, pl. vanillin-kénsav porlasztott reagenssel. Egy másik módszer szerint a tenyészet szilárd részeit, beleértve a tápközeg alkotórészeket és micéliumot, alkalmazhatjuk extrahálás vagy elkülönítés nélkül, de előnyösen a víz eltávolítása után, az A80577 forrásaként. így pl. A80577 termelése után a teljes fermentációs tenyészlevet meg lehet szárítani liofilezéssel, dob-szárítással vagy azeotróp desztillációval és szárítással. A szárított tenyészlevet közvetlenül be lehet keverni a takarmány- premixbe. Az A80577 sói használhatók az antibiotikumok elkülönítéséhez és tisztításához. A gyógyászatilag elfogadható sók különösen hasznosak. Sókra példák az A80577-nek alkáli-fém és alkáli-földfém sói. Az A80577 megfelelő alkáli-fém és aikáli-földfém sóinak képviselői között találjuk a nátrium-, kálium-, lítium-, cézium-, rubidium-, bárium-, kalcium- és magnéziumsókat. Az állatorvosi gyógyászat területén jól ismert, hogy egy antibiotikum formája általában nem nagy fontosságú, amikor egy állatot az antibiotikummal kezelünk. Legtöbb esetben az állaton belüli körülmények megváltoztatják a gyógyszert 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
