199883. lajstromszámú szabadalom • Eljárás véralvadásgátló proteinek és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 199883 B 2 A reakciókeverékek összetétele a kővetkező: A 1 /»M protrombin, 0,3 nM Xa faktor, 0,6 nM Va faktor, 0,5 /*m foszfolipid és 10 mM CaClj 12 antikoagulánssal ( ), 4,8 (/ig/ml antikoagulánssal (A) és antikoaguláns nélkül (•)• B 1 /ig protrombin, 10 nM X„ faktor, 0,5 /iM foszfolipid és 10 mM CaCl2 2,4 /ig/ml antikoagulánssal ( ), 0,48 /ig/ml antikoagulánssal (A) és antikoaguláns nélkül (•). C 1 /iM protrombin, 75 nM Xa faktor és 10 nM CaClj 120 /ig/ = ml antikoagulánssal (A) és antikoaguláns nélkül (•). A megadott időpontokban próbál veszünk és a már leírt módon meghatározzuk a keletkezett trombint. 14. ábra: Immunobiot módszer A blot-okat a leírás szerint kapjuk meg. 1. sáv: marha aortából izolált, VÁC aktivitású protein frakció. 2. sáv: marha aortából izolált, VÁC aktivitású protein frakció. 3. sáv: marha tüdőből izolált,VÁC aktivitású protein frakció. 4. sáv: humán köldökzsinór artériából izolált, VÁC aktivitású frakció. 5. sáv: patkány aortából izolált, VÁC aktivitású protein frakció. 6. sáv: ló aortából izolált, VÁC aktivitású protein frakció. 15. ábra: A Sephadex G75 eluátum különböző frakcióinak gélelektroforézise [A] és alvadásgátló hatása [B] A Sephadex G75-ról eluált különböző frakciók meghatározott mennyiségeit gélben elektroforetizáljuk, ahogy ezt leírjuk. A sávokat Merril és munkatársai szerint (lásd a fent idézett közleményt) ezüsttel festjük meg. 1-es futtatás: alacsony molekulasúlyú standard anyagok; 2 — 6 futtatás: azonos mennyiségű, növekvő eluciós térfogat szerinti, nem redukált G75 frakciók. A G 75 frakciók meghatározott mennyiségeit, amelyeket gél-elektroforézissel analizáltunk, MPTT-vel vizsgálunk (lásd a fenti leírást), amikor is az alvadás megindításához HTP-t alkalmazunk. A kontroll alvadási időket az üres hasábok jelentik. A sraffozott hasábok alatti számok a 15A. ábrán lévő eleklroforetikus futtatások számozásának felelnek meg. 16. ábra: A vaszkuláris alvadásgátló anyag hőinaktiválása Az alvadásgátlót 56 °C-on inkubáljuk és különböző inkubációs idők elteltével 5 /»1-es próbákat veszünk, amelyek 3,6 /tg proteint tartalmaznak. A próbákat azonban jéggel hűtjük, majd MPTT-vel vizsgáljuk, HTP - mint alvadás kiváltó — alkalmazása mellett. A kontroll próba alvadási ideje 110 másodperc. 1. példa A VÁC izolálása és tisztítása Vágás után fél órán belül kivesszük a marhákból az aortát. A marhavért trinátrium-citrátba (végkoncentráció: 0,38%) vesszük le, majd 10 percig szobahőmérsékleten 2,000 g mellett centrifugáljuk (15 percig 10.000 g mellett). Ilyen módon trombocita mentes plazmát (PFP) kapunk. Az állatok aortáját közvetlenül a kivétel után TBS-sel alaposan átöblítjük. Az aortákból az érbelhártyát eltávolítjuk és magasfordulatú homogenizátor, például Braun HX32 homogenizátor alkalmazásával, szója-tripszin-inhibitort (16 mg/ml) és benzamidint (1,57 g/l) tartalmazó TBSE-ben homogenizáljuk. A 8 aortából származó homogenizált anyagot, amely 20 l/tf.% szárazanyagot tartalmaz, 60 percen át 100.000 g-vel centrifugáljuk. A felülúszó folyadékot szilárd ammónium-szulfáttal 30%-ig telítjük, 30 percig keverjük és ezután 20 percig 12.000 g mellett centrifugáljuk. A kapott folyadékot szilárd ammónium-szulfáttal 90%-ig telítjük, 30 percig keverjük, s ezután 20 prcig 12.000 g-vel centrifugáljuk. A szárazanyagot kismennyiségű TBS-ben szuszpendáljuk és benzamidin (1,57 g/l) tartalmú TBS ellenében dializáljuk. A dializált frakciót hidroxi-apatit oszlopra (1x20 cm) visszük fel, amelyet TBS-el egyensúlyoztunk ki. Az oszlopot az agytérfogat négyszeresének megfelelő menynyiségű TBS-sel mossuk. A VÁC proteineket 200 ml nátrium-foszfát pufferrel (pH= 7,5), 0 — 500 mM lineár-grádiens alkalmazásával eluáljuk az oszlopról. Az alábbi vizsgálatok alapján meghatározott VÁC tartalmú frakciókat egyesítjük és 50 mM NaCl és 20 mM triszxHCl (pH = 7,5) tartalmú oldattal szemben dializáljuk. Ugyanezt a puffert használjuk a DEAE-Sephadex oszlop (3x5 cm) kiegyensúlyozására, amelyen a dializált VAC-anyagot kromatografáljuk. Az oszlopot négyszeres ágytérfogatnak megfelelő kiegyensúlyozó pufferrel mossuk, majd a VÁC eluálása 200 ml 20 mM-os triszxHCl-el (pH = 7.5) , 50 — 300 mM NaCl lineár-grádiens mellett történik. A VÁC tartalmú frakciókat összegyűjtjük, 500 mM NaCl és 20 mM triszxHCl (pH = 7.5) tartalmú oldattal szemben dializáljuk, s ezután Amicon cellában PM -10 ultraszűrő membrán alkalmazásával koncentráljuk. A koncentrált anyagot 2 ml térfogatban Sephadex G100 oszlopra (3x80 cm) visszük fel, miután az oszlopot 500 mM NaCl és 20 mM triszxHCl (pH = 7,5) tartalmú oldattal egyensúlyba hoztuk. Az eluátumot 2 ml-es frakciókban szedjük le, és az alábbiak szerint aktív frakciókat (1.1. ábra) elkülönítjük és 10 térfogat% glicerint tartalmazó TBS-el szemben dializáljuk, majd — 70 °C-on tároljuk. Az egész tisztítási eljárást 0-4 °C-on végezzük. A VÁC aktivitás meghatározása A VÁC aktivitás meghatározására két különböző módszert használunk: a) egylépcsős alvadási vizsgálatot (módosított protrombin idő vizsgálat), b) trombin képződési vizsgálatot. Az egylépcsős alvadási vizsgálatot a következőképpen végezzük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
