199883. lajstromszámú szabadalom • Eljárás véralvadásgátló proteinek és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 199883 B 2 és nincs tartós befolyása az Xa faktor aktivitására, mint ezt az S 2238, illetve S 2237 jelű kromogén szubsztráttanokkal megmértük (lásd a C táblázatot). Ebben a táblázatban azt is bemutatjuk, hogy a Xa faktor és a trombin/AT-lII inaktiválását nem erősíti a VÁC, ezzel szemben a heparin határozottan növeli az AT - III aktivitását. Ez azt mutatja, hogy a VÁC sem heparinszerű, aem AT - Ill-szerű aktivitással nem rendelkezik. Ugyanezen módszerrel humán véralvadásgátló protein izolálása is lehetséges elvileg, emberi köldökzsinór artériák homogenizátumából. Az antikoaguláns felfedezését az a tulajdonsága segítette elő, hogy egy protrombin-idő meghatározásnál az alvadási időt meghosszabbította. Az artéria-homobenizátum Sephadex G100-on történő frakcionálása után ez a képessége mérhetővé vált. Az izolálás további lépései alapján feltételezhető, hogy az aktivitás egy vagy több vízoldható anyagnak tudható be, amelyek pH 7,9 mellett együttesen negatív töltésűek. Egy Sephadex G75 frakció (az eddigi utolsó tisztítási lépés) gél-elektroforézises vizsgálatának eredménye szerint korreláció van a 32.000 molekulasúlyú sáv intenzitása és az MPTT-vel (modified protrombine time = módosított protrombin idő) mért alvadási idő meghosszabbodása közt (15. ábra). A 32K-sáv és az alvadás-ellenes aktivitás közti összefüggés kétségtelen, mivel a poliakrilamid gél 32K-sávjából véralvadás gátló aktivitás eluálható. Az eredmények alapján, illetve, hogy az antikoaguláns 56°C-on inkubálva aktivitását gyorsan elveszti, és a proteázok megsemmisítik az aktivitását, fel kell tételezzük, hogy nyilvánvalóan egyetlen 32.000 Dalton molekulasúlyú protein idézi elő az alvadás-ellenes aktivitást. A tripszin, az 1 típusú proteázzal ellentétben, rosszabb inaktivátora az antikoagulánsnak. Ez arra mutat, hogy az antikoaguláns csak kevés lizin- és arginin-csoportot tartalmaz, minthogy a tripszin számára ezek a hozzáférhetőek. A véralvadásgátlás hatásmódját a különbözőképpen kiváltott alvadásokon vizsgáltuk. Akár a vaszkuláris prokoagulánssal, a HTP-vel, akár az Xa faktorral váltjuk ki az alvadást, az antikoaguláns ezt gátolni fogja, de a trombin által indukált alvadást nem. Ebből arra lehet következtetni, hogy az antikoaguláns a trombin képződésénél nem játszik szerepet, de a trombin aktivitásánál igen. A találmány szerinti protein alvadásgátló mechanizmusának további felderítésére protrombinázt használtunk [J. Rosing, G. Tans, J. W. P. Govers-Riemslag, R.F.A. Zwaal és H.C.Hemker, J. Biol. Chem., 255, 274-283 /1980/]. A kísérleti feltételek mellett az antikoaguláns képes arra, hogy gátolja a protrombin aktiválódását, amelyet a teljes protrombináz (Xa faktor, Va faktor, foszfolipid, Ca2 + és a foszfolipidhez kötött Xa faktor (Xa faktor, foszfolipid, Ca2'*') idéz elő, de a szabad Xa faktor (Xa faktor, Ca2 + ) által történő aktiválódást nem. Az alvadásgátló anyag jelenlétében történő protrombin aktiválódás időbeli lefutása a protrombin aktiválódás azonnali gátlására utal, amely időben konstrans marad. Ebből megállapíthatjuk, hogy az antikoaguláns sem foszfolipázszerű hatást, sem proteolitikus hatást nem fejt ki. Az a tény, hogy a Xa faktor és Ca2+ által történő protrombin aktiválást egyáltalában nem befolyásolja az antikoaguláns, igen erős bizonyíték arra nézve, hogy e vaszkuláris protein alvadásellenes mechanizmusa az általánosan ismert plazmaproteáz inhibitorokétól — ilyen az antitrombin-111 - különbözik. Mint ahogy ezt Walker és munkatársai (F. J. Walker, P. W. Sexton és C.T. Esmon, Biochim. Biophys. Acta, 571. 333-342. /1979/) kimutatták, az aktivált C protein a Xa faktor, Ca2+ és foszfolipid által történő protrombin aktiválódást nem gátolja; ennek következtében a találmány szerinti protein nem identikus a C proteinnel sem. Az első kötési kísérletek arra mutatnak, hogy a vaszkuláris alvadásellenes szer a Xa faktornak és/vagy a protrombinnak a lipidhez való kötődésénél avatkozik be. Hogy vajon az antikoagulánsnak a protrombin aktiválódás teljes gátlását előidéző képessége felelős-e teljesen a protrombinidő vizsgálatban az alvadási időt meghosszabbító hatásért, még ki kell deríteni. Abból a tényből, hogy a találmány szerinti anyagot különböző fajta artériákból elő lehet állítani és gyengén ereződölt szövetekből nem, arra lehet következtetni, hogy a találmány szerinti protein a hemosztális és trombózis fiziológiás modulátora, amely vaszukuláris felületre hat. A VÁC meghatározott tulajdonságai és hatásai alapján a véralvadási mechanizmus a VÁC hatása alatt a következőképpen mehet végbe: A VÁC a Ca2 + ionokon keresztül negatív töltésű foszfolipidekhez kötődik, amelyek a szövetek sérülésekor és/vagy a stimulált trombociták révén keletke’znek és ezáltal csökkenti bizonyos alvadási faktoroknak (ezek a K vitamin-függő alvadási faktorok) negatív töltésű foszfolipid-felülcthez való kötődését, amely ezen alvadási faktorok számára katalizátor felületként hat (Biochem. Biophys. Acta, 515, 163 — 205. /1978/), és a következmény az lesz, hogy a foszfolipid-függő véralvadási reakciókat a VÁC gátolni fogja. A hatásmechanizmus alapján a VAC a 3. protein csoportba (lásd fent) sorolható. Döntő jelentőségű azonban mégis a VAC-nak az ezen csoportba tartozó proteinektől való különbözősége: a VÁC ugyanis nem hidrolizálja a foszfolipideket és így nem tudja a membránszerkezeteket lényegesen megbontani. Továbbá különösen jelentősek és előnyösek a VÁC azon tulajdonságai, amelyekkel még egyetlen eddig ismert antikoaguláns sem rendelkezik: — A VÁC alvadásellenes hatása azoknak a foszfolipideknek a mennyiségétől függ, amelyek az alvadási folyamatban résztvesznek. Ez a függőség azt eredményezi; hogy az alvadási folyamatot, amelyet például egy csekély érfal-károsodás és/vagy egy kismértékben trombocita aktiválódás vált ki - például egy trombotikus folyamat révén - a VÁC meglepő módon gátolhatja. Másrészt azt az alvadási folyamatot, amelyet egy 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
