199883. lajstromszámú szabadalom • Eljárás véralvadásgátló proteinek és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 199883 B 2 B. táblázat A VAC fém-ion függő kötődése negatív töltési foszfolipid liposzómákhoz Kation tc másod-EDTAC (10 mM) perc8 felülúszó Kontrol] (liposzóma nélkül) 180 N.D.d kontroll (kation nélkül) 174 64„8 CaCl2b 64,2 134 MgCl2 165 N.D.d MnCl2b 65,1 N.D.d a) A tc alvadási idő meghatározása az 1. példában leírt egylépcsős alvadási vizsgálattal történt. b) A foszfolipid-liposzóma reagens-oldatból (PS/PC; 50/50 mól/mp: 1 mM) 50 Ml-t és 100 pl 5% glicerin és a megfelelő kation tartalmú TBS- t (pH = 7,5) keverünk össze szobahőmérsékleten, a keveréket 15 percig 15.000 g mellett centrifugáljuk, a kapott felülúszó folyadék 25 /d-ét TBS-el 175 /d-re hígítjuk, majd az egylépcsős alvadási vizsgálattal mérjük. A felülúszó maradékát SDS-PAGE-el analizáljuk (4. ábra). c) A kapott liposzóma üledéket újból szuszpendáljuk 150 pl 5% glicerint és 10 mM EDTA-t tartalmazó TBS-ben (pH= 7,5). A sZuszpenziót 15 percig 15.000 g-val centrifugáljuk. A felülúszó VÁC aktivitását a b) pontban leírt módon mérjük. d) N.D. « nincs meghatározva. C táblázat A VÁC hatása a Xa faktor és a IIa faktor amidolitikus aktivitására A4os/percxl03 8 VÁC + X. 110,5 110,5 X„ AT-III 80,8 81,5 Xa, heparin Xa, heparin, 110,5 109,0 AT-III 47,5 N.D.b H. 7,5 8,5 II„ AT-III 5,4 5,6 Ila, beparin Ila, heparin, 7,5 7,1 AT-III 0,56 N.D.b a) Az amidolitikus aktivitást a következőképpen méijük: Xa faktort vagy a IIa faktort az említett anyaggal együtt TBSA-ban oldjuk. A reakciókeveréket teflonnal bevont keverővei, műanyag küvettában — amelyet termosztát segítségével 37 °C-on tartunk - keverjük; 10 perc múlva 100 pl (Xa) vagy 50 pl (Ila) mintát veszünk a küvettából. Ezt a mintát egy másik - 37 °C-os termosztáttal temperált - műanyag küvettába visszük át, amely 800 pl TBSE-t és 100 pl S 2337 reagenst (2 mM), illetve 900 pl S 2338 reagenst (5 mM) tartalmaz. Az abszorpció változását spektrofotométerrel (Kontroll Ovikon 810; 37 “C-os termosztáttal temperálva) 405 nm-en mérjük. A reakciókeverékben a különböző anyagok végkoncentrációja a következő volt: 18,7 nM Xa faktor, 1,5 nM IIa faktor; 18,7 nM AT —III; 1 egység/ml heparin és 10,7 pg/ml VAC (S.A. - 1.3000 egység'mg). b) Nincs meghatározva. 4. példa Vénapunkcióval emberi vért veszünk le trinátrium-citrát oldalba (végkoncentráció: körülbelül 13 mM citrát) és szobahőmérsékleten 10 percig 2.000 g mellett centrifugáljuk. Az így kapott plazmát újból 15 percig centrifugáljuk 10.000 g mellett, hogy trombocita mentes plazmát (PFP) nyerjünk. A standardként szolgáló PFP-t különböző egészséges véradók plazmájának keverékéből készítjük. Humán köldökzsinórokat gyűjtünk a születés után 15 perc elteltével. Az artériákat azonnal jéghideg TBS-pufferrel mossuk át, majd megtisztítjuk a Warton-féle géltől ("Jelly von Warton"), majd Braun MX32 típusú homogenizátorban homogenizáljuk. A 10%-os homogenizálumokat ezután frakcionáljuk. A 10.000 g-vel centrifugált homogenizátum felülúszójának frakcionálása Sephadex G100-on reprodukálható, specifikus elució képet ad (lásd a 7. ábrát). Azokat a frakciókat, amelyek az MPTT mérésénél az alvadási rendszert befolyásolják, a 7. ábrában mutatjuk be. Az előfrakcióval prokoaguláns aktivitás eluálódott. Ezt az aktivitást az MPTT vizsgálatban csak a VII faktor jelenlétében lehet kimutatni olyan kísérletekkel, ahol emberi veleszületett VII faktor hiányos plazmát használunk. Ennek megfelelően ezt a prokoagulánst szöveti tromboplasztinnak kell tekinteni. Azokat a frakciókat, amelyeknek kifejezett alvadás ellenes hatásuk van, egyesítjük, majd DEAE-Sephacel kromatográfiával tovább tisztítjuk (8A. ábra). Az antikoaguláns a DEAE-Sephacel-hez 50 mM NaCl és 50 mM trisz-HCl (pH = 7,9) sókoncentrációnál kötődik. Az aktivitást lineáris NaCl-grádiensben, pH = 7,9-nél, 150-160 mM NaCl-el eluáljuk. Az antikoaguláns aktivitást tartalmazó DEAE-frakciókat egyesítjük és gélszűrést végzünk. A Sephadex G75 használatával. Az oszlopot (1,5x50 cm) TBS-el egyensúlyozzuk ki. Az aktivitás a 30.000- - 60.000 Dalton molekulasúlyú frakciókkal oldódik ki. Az antikoaguláns mennyiségi meghatá5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
