199880. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 15-ös helyzetben levő lizin helyén más aminosavakat tartalmazó aprotinin homológok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 199880 B 2 7) L-Valin- 15-aprotinin* -hexametilészter 8) L-Valin-15-aprotinin A di-cisztenil-14,38-aprotinin*-hexametilésztérben és a di-cisztenil-14,l8-aprotinin*-pentametilészterben a 15 és a 16 helyzet között hasított peptidláncok még az 5/55, illetve a 30/51 félcisztinek diszulfidjaival kovalensen össze vannak kapcsolva, ami a képletsémából nem derül ki. A 15 helyzetű lizin karboxilcsoportjának szelektív szabaddá tétele céljából először, egy első reakciólépésben a 14. és 38. helyzetű ciszteinrészek közötti exponált diszulfidhidat merkaptoetanollal vagy előnyösen ditioeritrittel, önmagában ismert módon (W. K. Liu; J. Meienhofen, Biochim, Biophys, Acta 31, 467-473 /1968/) szelektíven redukáljuk. Ehhez 5 —100 mól ditioeritritet használhatunk 1 mól aprotinin*-hexametilészterre, előnyösen mintegy 15 mólt. A redukciót más ismert redukálószerrel is végezhetjük, így például nátrium-bór-hidriddel (L. Kress; M. Laskowski, J. Biol. Chem. 242, 4925-29 /1967/). A redukciót 3 és 7,5 pH-n, előnyösen 4,0 -6,5 pH tartományban vizes pufferoldatokban hajtjuk végre. Előnyös pufferek például a szukcinát-, foszfát- és az acetát-puffer, amelyek 0,005-0,5 mólosak, előnyösen 0,1 mólosak lehetnek. A feleslegben lévő ditioeritrit elválasztása céljából a reakcióoldatot közvetlenül, vagy bepárlás után egy megfelelő molekulaszitával töltött kromatografálóoszlopon szűrjük keresztül. Eluálószerként 2 — 6,5 pH értékű illékony pufferek használhatók, előnyösen a 0,05 — 0,1 mólos ecetsavat alkalmazzuk oldószerként. A 15 lizinrész karboxilcsoportjának szabaddá tétele azonban a ditioeritrit előzetes elválasztása nélkül is elvégezhető. A hexametilészter szelektív hidrolízisét előnyösen a cys 14 — 38 diszulfidhíd előzetes redukciója nélkül végezzük. így aztán elmarad a karboxipeptidáz hozzáadása előtti oxidációs lépés. A redukált aprotinin*-hexametilészter 15. helyzetű lizinrésze észtercsoportjának szelektív hidrolízise céljából a triplofánrészen formilezett tripszinnel reagáltatjuk, amelynek nincs amidoiitikus hatása, ellenben megfelelő aktiválás után még magas tripszinspecifikus észterolitikus aktivitása van. A szelektív hidrolízist megfelelő pufferoldatokban hajtjuk végre. Az erre a célra megfelelő pufferek elsősorban a foszfát-, szukcinát-, acetát- vagy a citrát-puffer. 0,01 — 0,5 mólosak lehetnek, előnyösen 0,1 mólosak. Az előnyös reakcióhőmérséklet 25 — 37 "C, a hidrolízis általában mégis 4—50 °C hőmérséklettartományban elvégezhető. A reakcióidők 1 és 48 óra között vannak, előnyösen 2-10 óra. A lizin 15-észter szelektív hidrolízise nem módosított tripszinnel is lehetséges, ha a reakcióoldathoz szerves oldószereket adunk, minthogy a tripszin proteolitikus aktivitását a szerves oldószerek, mint a dioxán vagy a formamid és a 2- klór-etanol is csökkentik. Az átalakításokhoz különösen olyan vizes pufferoldatok megfelelőek, amelyek dioxánnal vannak hígítva. Ilyenkor a dioxántartalom 30 és 75 térfogatszázalék közötti, előnyösen 40 és 66 térfogatszázalék közötti. Különösen az acetát-, szukcinát- és foszfátpufferek alkalmazhatók előnyösen pufferoldatként. Molaritásuk 0,01 és 0,5 közötti, előnyösen 0,05 és 0,2 mólos közötti és pH értékük 2 és 7 közötti, előnyösen 3,0 és 6,5 közötti. A szelektív észterhidrolízishez 0,1 — 30 mólszázalék tripszint alkalmazunk, előnyösen 1 — 10 mólszázalékot. Az enzimbeadagolástól és a pufferoldat pH értékétől függően a reakióidő 0,1- —10 óra. A szelektív észteresítéshez az aprotinin*-hexametilésztert előnyösen közvetlenül vagy a Cys 14 — 38 diszulfid redukciója után használhatjuk fel. A 2. ábrán az aprotinin*-hexametilészter 15 helyzetébe történő valin beépítés szintézisútját ábrázoltuk vázlatosan. Mint az 1. ábrán, az ábrázolás csak az aprotininmolekulának az aktív centrumot tartalmazó részére korlátozódik, a perifériális karboxilcsoportokkal kapcsolatos átalakításokat a képletábrán nem vesszük tekintetbe. Az anyagokat a következőképpen nevezzük: 1) Aprotinin 2) Aprotinin -hexametilészter 3) Aprotinin -pentametilészter 4) Dez-lizin- 15-aprotinin -pentametilészter, 5) L-Valin-15-aprotinin -hexametilészter 6) L-Valin-15-aprotinin A lizin 15-ön történő szelektív elszagpanosítás után a Cys 14 — 38 redukált aprotinin -pentametilésztert illetve aprotinin -pentametilésztert, valamint az el nem szappanosítolt kiindulási anyagot és a továbbmenő hidrolízissel képződő erősebben savas komponenseket és a modifikált tripszint, illetve tripszint a proteinkémiában szokásos módszerekkel elválasztjuk. Ilyen eljárásként megemlítjük a tripszin, illetve a modifikált tripszin kicsapását perklórsawal, vagy előnyösen triklór-ecetsawal, valamint megfelelő molekulaszitákkal töltött kromatografálóoszlopokon keresztül történő szűrést, amelynek során, az aprotinin*-származék meg meglévő tripszinnel szembeni aktivitása miatt eluálószerként 7,0 alatti, előnyösen 1,5 és 3,5 közötti pH értékű oldatokat alkalmazunk. Előnyös oldószer a 0,05 — 0,1 mólos ecetsav, amelynek pH értékét sósavval a kívánt értékre állítjuk. A gélszűréskor felhalmozódó, el nem szappanosítolt aprotinin*-hexametilészterből, a kívánt pentametilészterből és több észtercsoportján elszappanosított származékokból álló inhibitorfrakció, adott esetben ioncserélőkromatográfiával frakcionálható. A frakcionálási hasonló körülmények között végezzük, mint ahogy korábban (és részletesen az 1. példában) aprotinin* -hexametilészterre leírtuk. Cys 14 — 38 redukált diszulfidot tartalmazó aprotinin'-hexametilészter felhasználása esetén a 15 helyzetű lizinrész karboxipeptidázos lehasítása előtt a 14-es és 38-as cisztein közötti diszulfidhidat oxidációs úton kialakítjuk. Ezt az oxidációt 3,0 és 9,0, előnyösen 4,5 és 7,0 pH értékek között, levegőárammal történő oxidációval végezzük és a reakció előrehaladtát ellman szerint, az SH-értékek meghatározásával ellenőrizzük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
