199880. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 15-ös helyzetben levő lizin helyén más aminosavakat tartalmazó aprotinin homológok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 199880 B 2 boltjuk. A visszamaradt anyagot liofilizáljuk, és így 4,2 mg Ile-15-aprotinin-pcntametilésztert kapunk, melynek relatív retenciós ideje HPLC-n 1,87, relatív elektroforetikus mozgékonysága 1,75. Az aminosavösszetétel megfelel az elméletinek, az Ile- 15-aprotinin-pentametilészter jelenlétét egy 31 lépéses szekvencia-meghatározás igazolja. c) Izoleucin-15-aprotinin 2 mg Ile-15-aprotinin-pentametilésztert szobahőmérsékleten 60 óra hosszat 1 ml 0,1 mól/1- es, 10,5 pH-jú borát-pufferben tartunk, amely 0,32 mói/l-es volt imidazolra nézve. Ezután a sókat Spektrapor® dializálócsőben vízzel szemben végzett kimerítő dialízissel eltávolítjuk, és a maradékot liofilizáljuk. így 1,6 mg színtelen anyagot kapunk, amelynek relatív elektroforetikus mozgékonysága 0„02 mól/l-es Tris-glicin-pufferben 8,4 pH-nál 0,78, relatív retenciós ideje HPLC-n 0,87. Az aminosav összetétel megfelel az elméletinek. Az izoleucin-15-aprotinin gátolja a granulocita-elasztázt. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás olyan aprotinin homológok előállítására, amelyekben az aprotinin inhibitor aktív centrumában, a 15 helyzetben lévő lizinrész a glicin, L-valin, L-leucin, L-izoleucin, L-arginin, L-norvalin, L-norleucin aminosavrészek egyikére van kicserélve, azzal jellemezve, hogy a) az aprotininben a 15 helyzetű lizin és a 16 helyzetű alanin közötti peptidkötést enzimatikusan hasítjuk, 2) az összes szabad karboxilcsoportot karboxivédőcsoporttal ismert módon észteresítjük, 3) adott esetben a 14 és 38 helyzetű ciszteinrészek közötti diszulfidhidat szelektíven redukáljuk, 4) a 15 helyzetű lizin észtercsoportját szelektíven enzimatikusan elhidrolizáljuk, 5) a 14 és 38 helyzetű ciszteinrészek közötti S - S-hidat újra kialakítjuk, 6) a 15 helyzetű lizinrészt karboxipeptidázzal szelektíven lehasítjuk, 7) glicin, L-valin, L-leucin, L-izoleucin, L-arginin, L-norvalin, L-norleucin aminosavak egyikének egy észterét dez-lizinls-aprotinin*-pentametilészter karbodiimiddel kondenzáljuk, 8) a 15 helyzetű aminosav és a 16 helyzetű alanin közötti peptidkötést enzimatikusan újra kialakítjuk, és 9) a szabad karboxilcsoportok észtercsoportjait lehasítjuk, 10) és a tirozinrészek O-acil-karbamid-csoportjait hidroxilaminnal lehasítjuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 4. lépésben a szelektív hidrolizálást a triptofánrészen formilezett tripszinnel végezzük. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 4. lépésben a tripszinnel végzett szelektív hidrolizálást olyan vizes oldatokban végezzük, amelyek szerves oldószereket tartalmaznak. , 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 6. lépésben karboxipeptidázként karboxipeptidáz B-t használunk. 5. Eljárás gyógyszerészeti készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti eljárással előállított aprotinin homológok — amelyekben az aprotinin inhibitor aktív centrumában a 15 helyzetben lévő lizinrész a glicin, L-valin, L-leucin, L-izoleucin, L-arginin, L-norvalin, L-norleucin aminosavrészek egyikére van kicserélve — közül legalább egyet a gyógyszerkészítésben szokásos segédanyagokkal összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítunk. 5 10 15 20 25 30 35 40 13
