199877. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új ANF-származékok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 199877 B 2 A kívánt aminosavak, izomeijeik és a távtartó csoportokhoz alkalmazható amino-alkánsavak kereskedelemben kaphatók, vagy a szakirodalomban ismert eljárásokkal elóállíthatók. A találmány szerinti eljárást az alábbi példákon részletesen bemutatjuk. 1. példa Az (AoaH^)LANF<,_23.27-?«-NH? vegyidet előállítása --------------Az (Aoa24-26)rANF5_28-NH2 vegyület az (56) képletü anyag, azaz olyan (I) általános képletű vegyület, ahol a képletben Rj jelentése H-Ser-Ser-NH; X! és X3 jelentése metiléncsoport; Aoa24-26 jelentése amino-oktánsav távtartó csoport a 24 - 26 helyen. A vegyület alapszerkezete rANFs_23,27-28-A peptid szintézise standard szilárd-fázisú peptid szintézis eljáráson alapul, amelyben automata peptid szintetizátort alkalmazunk (applied Biosystems, Inc.). A szintézisben szilárd hordozóként p-metil-benzhidril-amin gyantát alkalmazunk (2% divinil-benzol) (Peptides International). A szimmetrikus Tyr anhidridet, amelyen Boc alfa-aminocsoport védőcsoport és 2Br-Z oldallánc hidroxilcsoport védőcsoport található, a védőcsoporttal ellátott Tyr és N,N-diciklohexilkarbodiimid diklórmetánban végrehajtott reakciójával állítjuk elő. A diklórmetánt dimetilformamidra cseréljük. A védett Tyr aminosav gyantához való ötését a szimmetrikus anhidrid oldatának szilárd fázisú reaktorba történő bevitelével végezzük, amely a gyantát tartalmazza. Az elegyet addig keverjük, amíg a kapcsolás teljessé nem válik. Az anhidrid oldatot körülbelül kétszeres feleslegben alkalmazzuk. A Tyr alfa-aminocsoport védőcsoportját a gyantához köttött Tyr származékot trifluor-ecetsawal reagáltatva eltávolítjuk. Alfa-aminocsoport védőcsoportként Boc csoportot oldallánc aminocsoport védőcsoportként p-toluol-szulfonil-csoportot(tozil) tartalmazó Arg-t N,N-diciklohexil-karbodiimid/l-hidroxi-benzotriazol (1:1) elegyével és a gyantához kötött Tyr származékkal dimetilformamidban reagáltatjuk és a gyantához, kötött Tyr származékhoz kapcsoljuk. Hasonló eljárás szerint a többi aminosavat is a gyantához kötött pepiidhez kötjük a megfelelő — az alábbiakban részletezett sorrendben. Valamennyi aminosav Boc alfaaminocsoport védőcsoportot tartalmaz. A fenti eljárás szerint jár nk el a kapcsolás után a peptid N-végcsoportjáról való alfa-aminocsoport védőcsoport eltávolításában. Aoa24 - 26; Cys, amely az oldallánc tiolcsoportján p-metil-benzil-csoport védőcsoportot tartalmaz; Gly; Leu; Gly; ser, amely az oldallánc hidroxilcsoportján Bzl-éter védőcsoportot tartalmaz; Gin; Ala; Gly; Ile; Arg, amely az oldallánc aminocsoportján tozilcsoport védőcsoportot tartalmaz; Asp, amely az oldallánc karboxilcsoportján ciklohexil-észter védőcsoportot tartalmaz; Ile, Arg, amely az oldallánc aminocsoportján tozilcsoporl védőcsoporlot tartalmaz; Gly; Gly; Phe; Cys, amely az oldallánc tiolcsoportján p-metil-benzil-védőcsoportot tartalmaz; Ser, amely az oldallánc hidroxilcsoportján Bzl-éter védőcsoportot tartalmaz; Ser, amely az oldallánc hidroxilcsoportján Bzl-éter védőcsoportot tartalmaz. Az Arg, Asn és Gin származékok gyantához kötött peptidhez való kapcsolása során diciklohexil-karbodiimid/l-hidroxi-benzotriazol (1:1) kapcsoló reagenst alkalmazunk dimetilformamidban. Valamennyi egyéb aminosav esetében a szimmetrikus anhidrid előállítását diciklohexil-karbodiimiddel diklórmetánban végezzük. A peptidet a gyantáról lehasítjuk és egyben az oldallánc védőcsoportokat eltávolítjuk a gyantához kötött peptidet anizol vízmentes hidrogénfluoridban készült (1:1) oldatával reagáltatva. A védőcsoport mentes peptidet káliumferricianiddal oxidáljuk és diszulfid hidat hozunk létre. A peptidet gélszűréses kromatográfia, ioncserélő kromatográfia, dialízis, és reverz fázisú nagynyomású folyadékkromatográfia (HPLC) segítségével tisztítjuk. Gyors atombombázású tömegspektrum (FAB-MS): (M + H)+ = 2341 Aminosav analízis (%): Asp (0,73); Glu (0,91); Ser (2,79); Gly (5,15); Alá (1,01); Arg (3.01) ; Tyr (0,98); ile (1,95); Leu (0,97); Phe (0,93); Aoa (1,01). Kitermelés: 14,11%. Hasonló eljárás alkalmazásával az alábbi peptideket állítjuk elő: (Aoa8 ~ 10)r ANF5 _ 711 _ 2sNH2; kitermelés 4,2 t%, FAB-MS: (M + H) + = 2427; aminosav analízis (%): Asp (1,24); Glu (0,88); Ser (3,72); Gly (3,16); Alá (1,07); Arg (3,01); Tyr (0,95); Ile (1,95); Leu (0,94); Phe (0,98); Aoa (1,07). (A017- 19)r ANF5 _ 16,20 - 28-NH2; kitermelés: 0,73 t%, FAB - MS: (M + H) + = 2404; aminosav analízis (%); Asp (1,31); Ser (2,88); Gly (5,18); Arg (2,95); Tyr (1,00); Ile (2,03); Leu (0,99); Phe (1,94); Aoa (0,70). (Aoa20 - 22)rANF5 _ 19 23- 28"NH2; kitermelés: 0,45 t%, FAB - MS: 1(M + H)+ = 2462; aminosav analízis (%): Asp (0,98); Ser (3,77); Asn (0,63); Gly (2,91); Glu (0,85); Arg (2,99); Tyr (1.02) ; Ile (2 33); Phe (2,20); Aoa (0,97). (Aoa15-1')rANF5_ 14 i8-28'NH2l kitermelés: 0,86 t%, FAB-MS: (M" + H)+ = 2447; aminosav analízis (%): Asp (1,77); Glu (0,96); Ser (3,62); Gly (4,21); Arg (2,91); Tyr (0,98); Ile (0,77); Leu (1,01); Phe (2,11); Cys (1,96); Aoa (0,80). (Aoa16 18)rANF5_15 i9_28-NH2; kitermelés: 1,8 t%, FAB - MS: (M + H) * « 2433; aminosav analízis (%): Asp (1,97); Ser (4,08); Gly (4,45); Arg (2,96); Tyr (0,95); Ile (1,124); Leu (0,96); Phe (1,92): Cys (1,46); Aoa (0,26). AÜ>-ltu/-hiO-'iU4-it)rA!NP ,27—28-NH2; FAB-MS: (M + H)+ = 1988; aminosav analízis (%): Asp (0,81); Ser (1,82); Gly (1.03) ; Arg (3,00); Tyr (0,96); lie (1,74); Cys (1,94); Aoa (3,07). Kitermelés: 3,6 t%. Az (1) képlett! vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények felhasználhatók olyan betegek kezelésére, amelyek betegsége túlzott folyadék, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
