199873. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vankomicin típusú antibiotikumok kinyerésére
1 HU 199873 B 2 HPLC-vel vizsgáljuk meg. Az A82846A komponensben (6-9. frakció) és az A82846B komponensben (10-17. frakció) gazdag frakciókat egyesítjük, és csökkentett nyomáson betöményítjük. Az A82846A-t tartalmazó betöményített oldatot, melyet a fentiek szerint kétszer 30 g nyers A82846-ból nyertünk 1750 ml-es Diaion HP— 20SS oszlopon sótalanítjuk oly módon, hogy az oszlopot először vízzel mossuk, majd 0,5% ecetsavat tartalmazó víz/izopropilalkohol, 95:5 elegygyel eluáljuk. A frakciókat analitikai HPLC-vel vizsgáljuk. Az A82846A komponenst tartalmazó frakciókat egyesítjük, betöményítjük és fagyasztva szárítjuk, 7,4 g A82846A komponensben gazdag preparátumhoz jutva. 7,2 g ilyen preparátumot vízben oldunk, és preparatív LP — l/Cjs szilikagél oszlopra viszünk, melyet 1%-os ammónium-dihidrogén-foszfát oldatban készítünk el. Az oszlopot grádiens elucióval eluáljuk 1%-os ammónium-dihidrogén-foszfát oldatból kiindulva, és 1%-os ammónium-dihidrogén-foszfát oldatból kiindulva, és 1% ammónium-dihidrogénfoszfát oldat/acetonitril, 9:1 eleggyel befejezve. Az áramlási sebesség 48 ml/perc. A detektálást analitikai HPLC-vel végezzük 254 nm-nél. Az A82846A komponenst (4—10. frakció) és az A82846B komponenst (12—20. frakció( tartalmazó frakciókat külön-külön egyesítjük, és csökkentett nyomáson bepároljuk. Három kromatografálásból származó egyesített A82846A koncentrátumot 1750 ml-es Diaion HP —20SS oszlopra vive sótalanítjuk oly módon, hogy az oszlopot vízzel mossuk, majd az A82846A komponenst 0,5% ecetsavat tartalmazó víz/izopropilalkohollal, 95:5 eleggyel eluáljuk. Az A82846A komponenst tartalmazó frakciókat egyesítjük, bepároljuk, fagyasztva szárítjuk, 7,9 g tisztított A82846A antibiotikumot kapva. Az előzőek szerint kapott A82846B komponensben gazdag preparátumot 1750 ml-es diaion HP-20SS oszlopon sótalanítjuk, először vízzel mosva az oszlopot, majd 0,5% ecetsavat tartalmazó víz/izopropilalkohol, 95:5 eluenssel eluálva. Az eluciót HPLC-vel követjük nyomon, az A82846B komponenst tartalmazó frakciókat egyesítjük, csökkentett nyomáson bepároljuk és fagyasztva szárítjuk. 8,8 g tisztított A82846B komponenst kapunk. A sótalanítást végezhetjük Diaion HP —20 gyantán is, eluensként 0,1% ecetsavat tartalmazó metanol/víz, 4:1 elegyet használva. Az A82846C faktor kinyeréséhez 461 liter fermentléből indulunk ki, amit négy 165 literes fermentálásból kapunk az előzőekben elmondottak szerint. A fermentlé kémhatását 5n nátriumhidroxid-oldattal pH » 10,5 értékre állítjuk be, és 3% Hyflo Supercel szűrési segédanyagot hozzáadva szűrjük. A 430 liter szűrlet kémhatását 5n sósavval pH » 7 értékre beállítva, az oldatot 10 liter Dowex XFS-43278, NH+4 formában levő gyantából készített oszlopra visszük. Az oszlopot 50 liter vízzel mossuk, az aktív anyagot 50 liter 0,05n ammónium-hidroxiddal eluáljuk, 4 literes frakciókat gyűjtve. Az eluciót biológiai módszerrel követjük nyomon. Az aktív frakciókat (1 — 7. frakció) egyesítjük, csökkentett nyomáson 1700 ml térfogatra töményítjük és fagyasztva szárítjuk, 283,9 g nyers A82846 antibiotikumot nyerve. 2 g nyers A82846 antibiotikumot vízben oldunk és egy 5,08x103,3 cm (2” x 45”) méretű rozsdamentes acélköpenyű preparatív HPLC oszlopra visszük, melynek töltete 2110 ml LP- 1/Cjg szilikagélből készült 1%-os ammóniumdihidrogén-foszfátban. Az oszlopot grádiens eluciónak vetjük alá 1%-os ammónium-dihidrogénfoszfát oldattal kezelve és 1%-os ammónium-dihidrogén-foszfátoldat/acetonitril, 92:8 eleggyel befejezve. Áramlási sebesség percenként 70 ml. 400 ml-es frakciókat gyűjtünk az eluciót 254 nmen nyomonkövetve. Külön-külön összegyűjtjük az A82846A (11-— 14. frakciók), az A82846C (16-20. frakcióki és az A82846B komponenst (21—25. frakciók) tartalmazó frakciókat. Az A82846C komponenst tartalmazó egyesített frakciókat 200 ml térfogatra pároljuk, és egy 7x45 cm-es üvegcsőben 1800 ml Diaion HP — 20 gyantából készített oszlopra visszük sótalanítás céljából. Az aktív anyagot 0,1% ecetsavat tartalmazó metanol/víz, 4:1 eleggyel eluáljuk 25 ml/perc átfolyási sebesség mellett, 1 literes frakciókat gyűjtve. Az A82846C komponenst tartalmazó frakciókat (9—12. frakciók) egyesítjük, csökkentett nyomáson bepároljuk és fagyasztva szárítjuk, 662,2 mg félig tisztított A82846C antibiotikumot nyerve. Ebből 500 mg-t tovább tisztítunk fordított fázisú HPLC-vel, 2,5x122 cm (1” x 48”) acéloszlopra töltölt 450 ml LP — l/C^g szilikagél tölteten. Az eluálást grádiens elucióval végezzük 1%-os ammónium-dihidrogén-foszfáttal indulva és 1%-os ammónium-dihidrogén-foszfát/acetonitril, 92:8 eleggyel befejezve. Az áramlási sebesség percenként 11 ml. 25 ml-es frakciókat gyűjtünk, az eluciót 254 nm-en detektáljuk. Az A82846C komponenst tartalmazó frakciókat (169 — 210. frakciók) egyesítjük, 5x45 cm-es üvegcsőben elkészített HP —20 gyantaoszlopon sótalanítjuk. Az oszlopot 0,1% ecetsavat tartalmazó metanol/víz, 4:1 eleggyel eluáljuk, 100 mles frakciókat gyűjtve. Az eluciót analitikai HPLC-vel követjük nyomon, 225 nm-en detektálva. Az A82846C antibiotikumot tartalmazó frakciókat (5 — 11. frakció) egyesítjük, csökkentett nyomáson bepároljuk és fagyasztva szárítjuk, 127,3 mg A82846C antibiotikumot nyerve. 70 mg A82846C antibiotikumot preparatív kromatográfiával tovább tisztítunk az alábbi kromatográfiás rendszert használva: oszlop: Zorbax SCX, kationcserélő; 9,2x250 mm; mozgófázis: lineáris grádiens: 10% metanolt tartalmazó 0,15M nátrium-dihidrogén-foszfát pufferról 6 perc alatt átváltva 10% metanolt tartalmazó 0,9M nátrium-dihidrogén-foszfátra, majd ezzel eluálva további 5 percen át (a puffer kémhatását nem állítjuk be); áramlási sebesség: 280 nm-en; felvitt anyag: egy injektálásnál 6,0 mg vízben oldott anyag. 5 10 15 20 25 30 35 4Q 45 50 55 60 65 5
