199860. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gangliozid-származékok és ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 199860 B 2 ménye, hogy serkentik az idegrendszer sarjadzási jelenségeit, és így regenerálódik az idegpályák vezetése. Ha például a szarvasmarha agyvelőből a 2. példa szerint előállított gangliozid keveréket in vivo vizsgáljuk, az kiváltja patkányokon az ülőideg sarjadzását, és ezért segítheti az ideg elektromos aktivitásának a helyreállását a neuromuszkuláris ízületnél. Tekintettel arra, hogy a neurit saijadzás lokalizált neurondifferenciálódásnak tekinthető, azokat a biokémiai mechanizmusokat, amelyekkel a gangliozid molekulák létrehozzák ezt a hatást, a sejtdifferenciálódásra gyakorolt hatásuk alapján tanulmányoztuk in vitro, a PC12 feokromocitoma sejttenyészeteinek alkalmazásával. Ha gangliozidokat adunk idegnövekedési faktorhoz, amely a PC 12 sejtek differenciálódásának kiváltója, akkor elősegítjük a PC 12 tenyészetben a neuronsaijadzást. Ez a hatás annak tulajdonítható, hogy a gangliozidok beépülnek a neuron membránba, s ennek hatására a membrán funkcionális tulajdonságai módosulnak, azaz az enzimaktivitás változik. Ténylegesen, a gangliozidoknak a neuron membránba történő beépülése képes a (Na+, K+)-ATPáz enzim aktivitásának növelésére. Annak hangsúlyozására, hogy mennyire fontos a membránhoz kapcsolt ezen enzim aktiválása, emlékeztetünk arra, hogy egyes kutatók a fenti enzim idegnövekedési faktor hatására bekövetkező aktiválásra vezetik vissza a tenyészetben lévő neuronsejtek túlélését, és így a differenciálódását. Másrészt ismeretes, hogy ez az enzim kulcsszerepet játszik az elektromos aktivitás biztosításában, mivel részt vesz abban az ionos mechanizmusban, amely az idegimpulzusoknak a gerincmembrán mentén való terjedését biztosítja. A fentebb ismertetett módszerek alapján meghatároztuk a találmány szerinti új ganlgiozid-származékok farmakológiai aktivitását a PC 12 sejtekben fellépő neuritsaijadzás segítségével. Azokat az eredményeket is ismertetjük, amelyeket (NA+, K+) ATPáz enzimmel in vitro kaptunk néhány gangliozid-származéknál. Gangliozid-származékok hatása a neurítsarjadzásra PC n sejteken Az alkalmazott anyagok és módszerek A PC 12 sejtvonalat (amely egy 1A alklóntól származott) dr. P. Calissano (C.N.R. Sejtbiológiai Laboratórium, Róma) biztosította részünkre. A sejteket (lemezenként 100.000) 37 °C hőmérsékleten tartjuk Heraeus inkubátorban (5 % széndioxid és 95 % nedvesített levegő), és felvisszük őket kollagén hordozón lévő 60 mm-es Falcon Integrid lemezekre az alábbi összetételű táptalaj jelenlétében: 85 % RPM 1640 (Gibco), 10 % hővel inaktivált lószérum, 5 % magzati borjúszérum, (Gibco), 50 egység/ml penicillin és 25 mg/ml sztreptomicin. A sejteket ezután háromszor mossuk szérummentes vivőanyaggal, majd olyan szérummentes vivőanyagban inkubáljuk, amely 50 ng/ml neuronnövekedési faktort és a vizsgálangó gangliozid-származékot tartalmazza, 10'6 M koncentrációban. Az összehasonlító vizsgálathoz gangliozidkeveréket használtunk ugyanebben a koncentrációban. Az 50 ng/ml neutronnövekedési faktort tartalmazó, szérummentes vivőanyag alkalmazásának az a hatása, hogy megszakítja a sejtburjánzást, és ekkor már a harmadik napon képződnek a neuritok és bekövetkezik a differenciálódás. Ezt a hatást úgy értékeljük ki, hogy a harmadik napon megszámoljuk a neuritokkal ellátott sejteket. Eredmények A kapott eredményeket az 1. táblázatban mutatjuk be. Összehasonlításul azokat az értékeket tüntetjük fel, amelyeket a 2. példa szerint előállított gangliozidkeverékkel és az egyetlen Gmi monoszialogangliozid frakcióval kaptunk. 1. táblázat Gangliozidok és gangliozid-származékok hatása a neuritsarjadzásra PC 12 sejtekben Vegyület Neuritokat (koncentrációja: 10"6M) tartalmazó sejtek száma a 3. napon, % Kontroll 21,.5 Gangliozidkeverék (GA) (lásd a 2 . példát) 39,5 Gmi monoszialogangliozid 34,8 GA metilésztere 32,8 Gmi metilésztere 35,7 GA etilésztere 34,9 Gmi etilésztere 37,1 GA izopropilésztere 37,3 Gmi izopropilésztere 37,0 GA tercier-butilésztere 29,5 Gmi tercier-butilésztere 32,3 GA benzilésztere 31,4 Gmi benzilésztere 28,3 GA allilésztere 34,1 Gmi allilésztere 31,5 Gmi etoxi-karbonil-metil-észtere 27,3 GA amidja 36,3 Gmi amidja 33,3 GA metilamidja 40,0 GA etilamidja 35,0 Gmi etilamidja 32,2 GA benzilamidja 26,7 Gmi benzilamidja 30,8 Gmi izopropilamidja 31,4 GA dimetilamidja 29,3 Gmi dimetilamidja 34,3 GA dietilamidja 25,0 Gmi dietilamidja 28,5 Gmi etil-metil-amidja 35,3 G A 3-(dimetil-amino)-propil-1 -amidja 32,9 Gm 1 3-(dimetil-amino)-propil-1 -amidja 37,3 Gmi dimetil-amino-etil-amidja 34,8 GA etanolamidja 38,3 Gmi etanolamidja 41,2 Gmi 6-hidroxi-hexil-l-amidja 36,4 Peracetilezett GA keverék 28,5 Peracetilezett Gmi 30,2 Peracetilezett GA metilészter 33,6 Peracetilezett Gmi metilésztere 29,4 Peracetilezett GA amidja 25,3 Peracetilezett Gmi amidja 31,4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 33
