199691. lajstromszámú szabadalom • Eljárás foszfatidil-inozit előállítására biológiai anyagokból
HU 199691 B nem célszerű végezni az ultraszűrést, mivel a termék hozama nem nő, viszont felesleges elektromos-energia-felhasználás válik szükségessé. A fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskéknek a vizes sóoldat-fázisbó! való elválasztására még egy további változat is lehetséges; a yizes sóoldat-fázisnak lúgos vagy semleges proteázokkal való kezelése. Az említett proteázok jelenlétében a nevezett részecskékről a fehérje nagy része eltávolítható, ezáltal a részecskék egymással összetapadnak és papíron vagy üvegszűrőn könynyen szűrhetővé válnak, így könnyen elkülöníthetők vagy centrifugálással alacsony, 500—1000 g nehézségi gyorsulás értékek mellett elválaszthatók. Ennél a változatnál a proteázokat 5—100 pg mennyiségben alkalmazzuk 1 ml vizes sóoldat-fázisra. Az említett tartományt az szabja meg, hogy az 5 pg/ml alatti proteázmennyiség nem elégséges a fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskék teljes elkülönítéséhez, míg a 100 pg/ml érték azért nem célszerű, mert nem hoz többlethatást, de felesleges reagens felhasználást jelent. A fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskék elválasztása az említett proteázokkal előnyös az egyéb eljárásváltozatokhoz képest. Ez az előny arra vezethető vissza, hogy a lúgos, illetve neutrális proteázok jelenlétében a fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskék összetapadása következik be, amelyek már papír- vagy üvegszűrőn könnyen és egyszerűen elkülöníthetők. A proteázok viszonylag olcsóak és hozzáférhetőek. Ezt követően az elkülönített fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskéket dietil-éterrel vagy acetonnal vagy egyéb hasonló szerves oldószerrel kezeljük, hogy eltávolítsuk belőle a lipid szennyeződéseket. Ezután a terméket metanollal, metanol és kloroform elegyével vagy desztillált vízzel extraháljuk. A foszfatidif-inoz.it a biológiai kiindulási anyagban lévő mennyiségre vonatkoztatva 90%-os hozammal nyerhető ki ezzel az eljárással. Amint az a későbbiekben ismertetendő részletes leírásból kitűnik, a találmány szerinti eljárás technológiai kivitelezése egyszerű, az eljárás nem igényel nagy oldószermenynyiséget, javítja a munkakörülményeket, a szükséges időtartamot körülbelül felére-negyedére csökkenti és jelentősen csökkenti a termék költségeit. A következőkben részletesen ismertetjük a találmány szerinti eljárás legjobb megvalósítási módját. Biológiai anyagként gabonakorpát, például búzakorpát alkalmazunk. A korpa homogenizálását pH=8,3—8,5-ös, 0,05—0,1 mól/literes trisz-hidroxi-amino-metán-klorid oldattal való eldőrzsöléssel végezzük, miközben a korpaszemcsék szétroncsolódnak, és a fe-5 fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskék a; vizes sóoldat-fázisba jutnak. A kapott homogenizátumot Í0 000 g nehézségi gyorsulás mellett 10 percig végzett homogenizálással szétválasztjuk. A centrifugálás során a sejtmentes vizes sóoldat-fázisba kerülnek a fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskék, és így elkülönülnek az egyéb foszfolipideket tartalmazó szétroncsolatlan sejtektől és részecskéktől. A kapott sejtmentes vizes sóoldat-fázisból a fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskéket 1 ml sóoldat-fázisra számított 0,05 mg (50 pg) lúgos- vagy semleges-proteázzal végzett kezeléssel különítjük el. A kezelés során a fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskék összetapadnak és 10 000 g nehézségi gyorsulás mellett végzett centrifugálásnál a fázisból kiválnak. A kivált fehér je-foszfatidil-inozit-komplex részecske csapadékot dietil-éterrel kezelve eltávolítjuk belőle a szennyeződésként jelenlévő lipideket. A tisztított fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecske csapadékot metanollal extraháljuk. A hozam mintegy 93%-os a kiindulási anyagként szolgáló búzakorpában való elfordulásra vonatkoztatva. A továbbiakban a jobb megértés kedvéért a találmányt példákkal világítjuk meg. 1. Példa 10 g kukoricalisztet pH=9,0-es, 0,05 mól/liter vizes dinátrium-hidrogén-foszfátban porcelánmorzsában homogén állapotig dörzsöljük. A sejtmentes vizes sóoldat-fázis elkülönítésére a homogenizátumot 5 pm-es pórusátmérőjű szűrőn szűrjük. A sejtmentes vizes sóoldat-fázist gélkromatográfiás eljárással Sepharose 4B-töltetű oszlopon engedjük át, a fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecske tartalmú frakciókat összegyűjtjük, és vákuumbepárlón szárazra pároljuk. A visszamaradó anyagot 50 ml acetonnal kezeljük a lipidszennyezések eltávolítása céljából. A kapott terméket kétszer desztillált vízzel extránál juk. Ily módon 8,9%-os hozammal 0,09 g terméket nyerünk. 2. Példa 10 g borsószemet malomban megőrlünk, majd az Őrölt anyagot késes homogenizátorban pH=ll,0 értékű, 0,1 mól/literes nátrium-karbonát-oldattal homogenizáljuk. A homogenizátumot 10 000 g nehézségi gyorsulás mellett 10 percig centrifugáljuk. A kapott sejtmentes vizes sóoldat-fázist 30 000 g nehézségi gyorsulás mellett végzett centrifugálással kiülepítjük. A csapadékot 50 ml dietil-éterrel átmossuk, a mosott anyagot 5 ml metanollal extraháljuk. így 65%-os hozammal 0,02 g terméket nyerünk. 3. Példa 10 g makkot malomban megőrlünk. A kapott lisztet pH=5 értékű, 0,1 mól/literes nátrium-acetáttal eldörzsöljük. A kapott homogenizátumot 10 000 g nehézségi gyorsu6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
